? ? ? ?前面小編帶大家了解了腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）載體的基因遞送過程，相信對AAV有了初步認(rèn)識。那么AAV是如何包裝得到的呢？本期咱們就來了解下AAV 的包裝流程。

一、AAV 介紹

腺相關(guān)病毒（AAV）屬微小病毒科（parvovirus），為無包膜的單鏈線狀DNA 病毒。只有在腺病毒或者皰疹病毒等輔助病毒協(xié)助下，宿主才能產(chǎn)生具有感染性的AAV，所以AAV被稱作腺相關(guān)病毒。典型的AAV2基因組約4800bp，包括2個反向末端重復(fù)序列（ITR，145 bp）和兩個讀碼框（ORF）-Rep和Cap（圖1）。ITR對合成互補DNA鏈?zhǔn)潜匦璧模籖ep和Cap可以翻譯成多種不同蛋白，如AAV 生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3 等。AAV病毒系統(tǒng)就是用目的基因替換掉Rep和Cap，然后與表達(dá)Rep和Cap基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生包含目的基因的AAV。目前AAV有12種野生型血清型、100多種變體。不同的血清型對組織或器官有著不同的親和性。由于安全性高、免疫原性小、表達(dá)周期久等優(yōu)點，AAV被認(rèn)為是目前最適合在體（in vivo）研究基因功能的利器。

圖 1、 AAV2 基因組結(jié)構(gòu)示意圖

二、整體包裝流程

圖 2、 AAV 包裝實驗流程圖

三、實驗材料

1. AAV包裝系統(tǒng)：目的基因表達(dá)質(zhì)粒（過表達(dá)、干擾等）pHBAAV-xxx、包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper。

2. 菌株：大腸桿菌菌株 Stbl3。用于擴(kuò)增 pHBAAV-xxx及其包裝質(zhì)粒。

3. AAV病毒的包裝細(xì)胞株：AAV-293，生長培養(yǎng)基為DMEM + 10% FBS + 雙抗（完全培養(yǎng)基）。

四、AAV包裝與純化

1．載體構(gòu)建

AAV 包裝之前需要構(gòu)建表達(dá)目的基因的載體 pHBAAV-xxx?？梢宰杂蛇x擇啟動子、熒光標(biāo)記、是否需要Cre 依賴等特點進(jìn)行定制。質(zhì)粒構(gòu)建完成后需要轉(zhuǎn)化后再使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒抽提，要求濃度不低于1μg/μl，A260/280在1.7~1.8。

2．AAV包裝

??事先準(zhǔn)備好用于包裝病毒的AAV-293細(xì)胞（50-70%的匯合度，無支原體污染）和病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染一個10 cm培養(yǎng)皿，成分如下：

表1、AAV 包裝過程中轉(zhuǎn)染一個標(biāo)準(zhǔn)10 cm dish所需要質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑用量

???????DMEM 需在 37℃水浴中預(yù)熱，LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑建議恢復(fù)至室溫后使用，使用前需搖勻。轉(zhuǎn)染后 6 h 換新鮮培液。

3．AAV收集和純化

轉(zhuǎn)染后72 h，收集所有的細(xì)胞用液氮反復(fù)凍融三次收集上清液，然后使用 Benonase酶消化，所得上清用Biomiga品牌純化柱純化，所得病毒分裝后于-80°C保存。AAV滴度測定采用國際標(biāo)準(zhǔn)對ITR或者WPRE元件進(jìn)行qPCR絕對定量。

五、AAV 安全使用注意事項

1) AAV 相關(guān)實驗請在生物安全柜（BL-2 級別）內(nèi)操作。

2) 操作病毒時請穿實驗服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3) 操作病毒時特別小心病毒濺出。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請用84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

4) 如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，如有必要請用封口膜封口后離心。

5) 動物注射操作請在生物安全柜內(nèi)（BL-2 級別）完成。

6) 病毒相關(guān)的廢棄物需要特殊收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。

7) 實驗完畢用洗手液清洗雙手。

??以上就是AAV包裝的具體流程了，如有相關(guān)問題或需要構(gòu)建AAV，歡迎隨時與我們聯(lián)系。