膽固醇是一種重要的細(xì)胞成分，維持膽固醇穩(wěn)態(tài)對正常生理功能至關(guān)重要。血漿膽固醇水平升高與各種病理狀況有關(guān)，最明顯的是冠心病，高膽固醇水平導(dǎo)致動脈泡沫細(xì)胞形成和斑塊堆積，可能導(dǎo)致心臟病發(fā)作或中風(fēng)。細(xì)胞膽固醇代謝和血漿膽固醇水平的調(diào)節(jié)取決于低密度脂蛋白（LDL）受體介導(dǎo)的LDL向特定細(xì)胞的攝取。

?

LDL是血液中膽固醇的主要載體，占血漿總膽固醇的60%以上。LDL通過apoB-100-LDL受體相互作用引發(fā)的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被肝組織和肝外組織吸收。內(nèi)化的LDL顆粒被運(yùn)送到溶酶體，在溶酶體中降解為游離膽固醇和氨基酸。在人類中，肝臟是LDL分解代謝和LDL受體活性最重要的器官。在肝臟中，LDL可以通過藥物干預(yù)來調(diào)節(jié)。

?

細(xì)胞低密度脂肪酸(LDL)攝取試劑盒為研究細(xì)胞水平的LDL攝取和調(diào)節(jié)提供了方便的工具。該試劑盒使用與DyLight結(jié)合的人LDL? 550（Thermo Fisher Scientific Inc.的產(chǎn)品）作為熒光探針，用于檢測培養(yǎng)細(xì)胞對LDL的攝取。LDL受體特異性多克隆抗體和DyLight? 488綴合的二級抗體用于鑒定LDL受體的分布。

?

艾美捷細(xì)胞低密度脂肪酸(LDL)攝取試劑盒為研究細(xì)胞水平的LDL攝取和調(diào)節(jié)提供了便利的工具。該試劑盒采用人類低密度脂蛋白結(jié)合到DyLight??550作為熒光探針，用于檢測培養(yǎng)細(xì)胞中LDL的攝取。LDL受體特異性多克隆抗體和DyLight? 包括488個偶聯(lián)的二抗，用于鑒定LDL受體的分布。

?

艾美捷細(xì)胞低密度脂肪酸(LDL)攝取試劑盒試劑準(zhǔn)備：

1.LDL-DyLightTM 550工作溶液

稀釋LDL DyLight? 550（項(xiàng)目編號10011229）1:100，在適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)基中。在加入細(xì)胞之前，用0.45μm過濾器去除顆粒。

2.TBS-Triton緩沖液

通過將Triton X-100添加到TBS中制備TBS Triton緩沖液

濃度為0.1%。

3.兔抗LDL受體一級抗體

在TBS Triton緩沖液中稀釋兔抗LDL受體一級抗體（項(xiàng)目編號10012422）1:100。

4.DyLightTM?488偶聯(lián)山羊抗兔IgG二級抗體

稀釋DyLight? 488綴合的山羊抗兔IgG二級抗體（項(xiàng)目號10011231），1:100，TBS Triton緩沖液。

?

細(xì)胞處理和LDL DyLightTM 550的攝取：

以下方案適用于96孔板。對于其他尺寸的板，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整每個孔的介質(zhì)/溶液體積。我們建議每種治療重復(fù)或三次。

1.用3 x 104個細(xì)胞/孔接種96孔板，并培養(yǎng)細(xì)胞過夜。對于HepG2細(xì)胞，在治療前使細(xì)胞生長兩天。

2.第二天或第三天，用實(shí)驗(yàn)化合物或載體處理細(xì)胞24小時，或在典型實(shí)驗(yàn)方案中使用的時間段。

3.治療期結(jié)束時，用75-100μl/孔LDL DyLight替換培養(yǎng)基? 550在無血清培養(yǎng)基中制備的工作溶液。將細(xì)胞在37°C下再培養(yǎng)3-24小時，或在典型實(shí)驗(yàn)方案中使用的時間。

4.在LDL攝取培養(yǎng)結(jié)束時，抽吸培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基或PBS代替。在顯微鏡下用能夠分別測量激發(fā)波長540和發(fā)射波長570nm的濾光器檢查LDL攝取的程度。細(xì)胞現(xiàn)在準(zhǔn)備好使用第8頁所述的程序?qū)DL受體進(jìn)行免疫熒光染色。

?

艾美捷細(xì)胞低密度脂肪酸(LDL)攝取試劑盒性能特性：

?

圖：Huh7人肝細(xì)胞LDL攝取。將Huh7細(xì)胞以1 x 104個細(xì)胞/孔接種在96孔板中，并使其附著和生長24小時。將LDL DylightTM 550以1:100的稀釋度加入無血清培養(yǎng)基中并孵育過夜。通過將Hoechst 33342（項(xiàng)目編號15547）直接添加到培養(yǎng)基中至最終濃度為5μM并在37°C下孵育30分鐘，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。LDLR染色如試劑盒手冊所述完成。使用配備Roper Scientific相機(jī)和MetaMorph軟件的尼康Eclipse顯微鏡拍攝熒光圖像（200X），并合并到ImageJ中。圖A：綠色LDLR染色，圖B：紅色LDL攝取，圖C：藍(lán)色Hoechst，圖D：合并圖像。