前言

藥物性肝損傷(DILI)是藥物安全使用的主要問題之一。在傳統(tǒng)醫(yī)學中用于治療炎癥、細菌感染和過敏的Cortex Dictamni（CD）對肝臟有毒性作用。根據(jù)之前報道，以Fraxinellone（FRA）為代表的幾種呋喃環(huán)化合物是從CD中提取的主要活性成分，會導致肝毒性。肝臟作為氨基酸代謝的重要器官，在氨基酸代謝平衡中起重要作用。當肝細胞受到嚴重損傷時，會導致氨基酸代謝紊亂。因此，氨基酸可能是很好的DILI生物標志物。

2022年4月，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所靳洪濤教授課題組在molecules發(fā)表的題為“Fraxinellone Induces Hepatotoxicity in Zebrafish through Oxidative Stress and the Transporters Pathway”（IF:4.411）的研究成果，通過氨基酸靶向代謝組學研究方法，發(fā)現(xiàn)了斑馬魚肝損傷的氨基酸水平變化特征，探究了Fraxinellone致斑馬魚肝毒性的機制，為防治藥物性肝損傷提供了理論依據(jù)。

中文標題：Fraxinellone 通過氧化應激和轉(zhuǎn)運途徑誘導斑馬魚的肝毒性

研究對象：斑馬魚

發(fā)表期刊：molecules

影響因子：4.411

發(fā)表時間：2022年4月

合作單位：中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所

運用生物技術：氨基酸靶向代謝組學

研究背景

氨基酸代謝組學可用于了解在氨基酸水平上DILI是否可與健康對照區(qū)分，組間代謝特征和代謝產(chǎn)物氨基酸的差異也可以解釋中草藥致DILI的不同機制。目前對FRA肝毒性機制的研究大多僅限于體內(nèi)藥代動力學檢測和肝微粒體系統(tǒng)代謝組的結(jié)構(gòu)鑒定。因此，本研究選擇了模式生物斑馬魚，目的是在研究代謝激活的分子機制的基礎上，尋找體內(nèi)可能的毒性途徑和代謝標志物，為臨床預防和治療藥物性肝損傷奠定基礎。

研究思路

研究結(jié)果

1、Fraxinellone對斑馬魚幼蟲的肝毒性作用

以30μM（LD 10）的亞致死劑量為上限，在超景深顯微鏡下發(fā)現(xiàn)正常斑馬魚幼蟲的肝臟在顯微鏡下比較透明，但用肝毒性藥物處理后，肝臟組織質(zhì)地無定形，結(jié)構(gòu)紊亂，顏色變黑，表示肝臟退化。用10、20或30 μM FRA處理48 h后，斑馬魚肝臟區(qū)域變黑，灰度值隨著FRA濃度的增加而降低（圖1A）。

熒光顯微鏡下，AO染色顯示，斑馬魚幼蟲暴露于FRA后熒光強度增加，凋亡細胞比例高于空白對照組（圖2C）。斑馬魚勻漿上清液中的 ALT、AST、TBIL 和 DBIL 水平以濃度依賴性方式顯著增加（圖2 D-G）。這些結(jié)果表明FRA對斑馬魚幼蟲有很強的肝毒性。

圖1 | FRA 對斑馬魚幼蟲的肝毒性作用

2、FRA 誘導的肝毒性的組織病理學評估

通過用蘇木精和伊紅 (H&E) 染色進行 FRA 誘導的肝毒性的組織病理學評估（圖 2）。低倍率成像證實肝臟位于斑馬魚的腹腔內(nèi)，周圍的腸和胰腺也可見。高倍鏡下，空白對照組斑馬魚肝細胞完整，排列緊密規(guī)則，細胞核呈圓形，位于細胞中心。FRA給藥組斑馬魚肝細胞腫脹，由于脂肪變性，細胞核向細胞一側(cè)擁擠，肝細胞細胞質(zhì)空泡化，點狀或局灶性壞死，呈現(xiàn)肝損傷的典型表現(xiàn)。

圖2 | FRA 對肝臟形態(tài)的影響

3、FRA對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和JNK/p53通路表達的影響

通過 qRT-PCR探究參與維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)（P-gp、Bsep 和 Ntcp）和細胞凋亡調(diào)節(jié)（JNK1、p53 和 caspase-3）基因的表達水平。與對照組相比，F(xiàn)RA高劑量組Bsep、P-gp和Ntcp的mRNA表達水平下降（圖3A -C），JNK1、caspas -3e的mRNA表達水平降低，p53的mRNA表達水平增加（圖 5D-F)。

蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明JNK和p53的磷酸化水平以濃度依賴性方式顯著增加。JNK促凋亡途徑下游標志物Bax 和cleaved caspase-3的蛋白質(zhì)水平隨著JNK磷酸化水平的增加而增加（圖 5 G-K）。與對照組相比，F(xiàn)RA組JNK磷酸化水平升高，促進線粒體中凋亡蛋白Bax的表達，進一步促進細胞凋亡。

圖3?| FRA 對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和 JNK/p53 通路成分表達水平的影響

4、KCZ 對 FRA 誘導的肝毒性的抑制作用

相同的給藥條件下，添加KCZ的濃度越高，F(xiàn)RA 誘導的死亡率顯著降低（圖 4A）。選擇1 μM KCZ作為后續(xù)機制驗證的安全劑量。聯(lián)合給藥48 h后，KCZ聯(lián)合處理組ALT、AST水平較FRA處理組明顯下降，TBIL、DBIL水平下降，與空白對照組相比無顯著性差異（圖4 B-E）。

圖4?| 成纖維細胞靶向慢病毒Trps1過表達和敲除

5、KCZ 改變了 FRA 抑制的轉(zhuǎn)運蛋白和凋亡蛋白的表達模式

qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與 FRA 處理組相比，KCZ 恢復了FRA 抑制的Bsep、P-gp和Ntcp的 mRNA 表達水平，并顯著降低了 cyp3a65 mRNA 水平（圖 5 A-D）。表明KCZ 可以通過抑制 CYP3A 亞家族成員的表達來減少 FRA 有毒代謝物產(chǎn)生。與 FRA 治療組相比，p53和caspase-3的 mRNA 表達在KCZ聯(lián)合處理組顯著下降，cleaved caspase-3蛋白表達下降，與空白對照組無顯著差異，證實CYP3A抑制劑KCZ改善了FRA的毒性（圖5 E-G）。

圖5 | KCZ 改變了 FRA 抑制的轉(zhuǎn)運蛋白和凋亡蛋白的表達模式

6、KCZ 恢復被 FRA 改變的氨基酸代謝

為進一步驗證FRA的肝臟毒性和KCZ的毒性抑制作用，采用靶向代謝組學方法檢測斑馬魚體內(nèi)氨基酸的動態(tài)變化。PCA結(jié)果表明，在95%的可信區(qū)間內(nèi)，KCZ處理組和空白對照組重疊最多，而FRA處理組和空白對照組有顯著差異。

與FRA處理組相比，KCZ和FRA聯(lián)合處理組的氨基酸代謝產(chǎn)物呈回調(diào)趨勢，并與空白對照組部分重疊(圖6A)。熱圖顯示，F(xiàn)RA處理后斑馬魚體內(nèi)半胱氨酸、谷氨酸、亮氨酸和色氨酸的含量顯著降低，而解毒產(chǎn)物谷氨酰胺顯著增加。KCZ共同處理后，這些氨基酸的表達水平基本恢復(圖6B)。

圖6 | KCZ 恢復了 FRA 改變的氨基酸代謝譜

相關討論

在本研究結(jié)果中，氨基酸代謝組學揭示FRA誘導肝損傷后，細胞中異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的含量顯著下降，表示支鏈氨基酸可能是潛在的肝損傷標志物。FRA還可引起其他氨基酸代謝紊亂，如脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸含量下降，表明FRA可以顯著地誘導斑馬魚氨基酸代謝的失調(diào)，導致氧化應激誘導的肝損傷。揭示內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，如氨基酸水平的變化，可以作為早期監(jiān)測肝臟毒性的潛在標志物。ketoconazole (KCZ)共處理后，氨基酸的表達水平恢復，可以為預防和治療藥物性肝損傷提供新的方法。

小鹿推薦

為探究藥物性肝損傷的毒性途徑和代謝標志物，本文從肝細胞受到損傷，氨基酸代謝會發(fā)生紊亂角度出發(fā)，綜合氨基酸代謝組學結(jié)果，探討斑馬魚肝毒性機制，為防治藥物性肝損傷提供理論參考。

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