? ? ? ? 瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)中最常見的鑒定DNA的方法，它簡便易行，只需少量DNA。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動是由電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)所致，前者由分子所帶電荷量的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)想有關(guān)。DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的泳動速度取決于DNA分子的大小和構(gòu)象。

具有不同相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不同，DNA分子的遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。另外DNA分子的構(gòu)象也可影響其遷移速度，同樣相對分子質(zhì)量的DNA，超螺旋共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA（covalently?closed?circular?DNA，cccDNA）遷移速度最快，線性DNA（lniear?DNA）其次，開環(huán)（open?circular?DNA，cDNA）最慢。

? ? ? ? 觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料溴化乙啶（EB）染色，EB分子是一種扁平分子，在紫外燈的照射下，發(fā)出紅色熒光。當DNA在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB就可以嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成一種熒光絡(luò)合物，使發(fā)射的熒光增強幾十倍。但是溴化乙啶是有毒的，是潛在的誘變劑，現(xiàn)在做實驗常用4S?Green核酸染料來代替，我們實驗室就是用的4S?Green核酸染料。它和EB一樣敏感，并且與EB在瓊脂糖凝膠電泳中的使用方法相同，當與dsDNA，ssDNA和RNA結(jié)合時，這種染色劑會發(fā)出綠色熒光。推薦使用非LED照明器，如藍光LED。

? ? ? ? 瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離不同長度的DNA，見下表。

1?實驗器材

1.1?試劑

（1）5×TBE溶液：將54gTris，27.5g硼酸置于燒杯中，再加入0.5M的EDTA（pH?8.0）20mL，最后定容至1L。使用時可根據(jù)實驗所需進行稀釋。一般電泳需要稀釋5倍或者10倍。

（2）瓊脂糖：直接購置。

（3）凝膠加樣緩沖液：1%TBE或者TAE。

（4）DNA相對分子質(zhì)量標準樣品（marker）：直接購置于生工，按照自己樣品的需要用合適的marker。

（5）10×?Loading?Buffer緩沖液。

1.2?器材

（1）一次性手套、燒杯、移液器、移液器槍頭、錐形瓶、量筒、膠頭滴管、微波爐（電熱恒溫水浴鍋）、穩(wěn)壓電泳儀、紫外檢測儀、水平式電泳槽、電子秤、攝影設(shè)備。

（2）DNA樣品（正常是PCR過的需要的樣品）。

2?實驗操作

????操作過程都需要穿實驗服戴手套。

2.1?瓊脂糖凝膠的制備

（1）洗凈有機玻璃制膠內(nèi)槽，置于槽內(nèi)，水平備用。

（2）根據(jù)制膠槽的大小，稱取一定質(zhì)量所需的瓊脂糖（我們是稱取0.2g），放入錐形瓶中，按照所需的濃度1%～2%加入適量的1×TBE或者TAE緩沖液（我們是加入20mL1×TAE緩沖液），置于微波爐或者水浴加熱至完全融化，取出搖勻，迅速加入2μL?4S?Green核酸染料（加4S?Green時需要用移液槍在液面以下打下去，錐形瓶立即在桌面上慢速打圈混勻，以免染色劑混不勻或者產(chǎn)生氣泡）。

2.2?凝膠板的制備

（1）將上一步制好的瓊脂糖凝膠冷卻至60℃緩慢倒入制膠模槽，厚度一般為3～5mm，放好梳子，排除梳齒間或梳齒下的氣泡（一般輕輕抖動梳子即可或者用干凈無菌的槍頭勾除）。

（2）室溫放置20～30min試瓊脂糖完全凝固，小心取出梳子，撤除大模槽，將膠槽置于電泳槽中，加入1×TBE或者TAE緩沖液，使液面高于膠面約1mm。注意：電泳槽緩沖液和配制凝膠的緩沖液應(yīng)完全一致，最好為同一配制的溶液。

2.3?加樣

取樣品液和標準品DNA各5μL，樣品DNA各加入2μL的10×?Loading?Buffer緩沖液，混勻后，用微量加樣器（移液槍或注射器）將樣品點入點樣孔中，槍口最好不要碰孔壁。正常第一個孔什么都不加，第二個孔加DNA標準樣品DNA，后面挨著加樣品。

2.4?電泳

（1）接通電泳儀和電泳槽，注意DNA向正極移動，加樣端要接負極。DNA的遷移速度與電壓成正比，電壓選擇為80～90V。

（2）當樣品移動到大約1/2的時候可以拿出來觀察一下，移動到3/4的時候就可以停止電泳了。

2.5?觀察

在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并可將凝膠置于紫外投射儀的玻璃板上，打開紫外燈，觀察結(jié)果，如果結(jié)果良好可以使用，可以用凝膠自動成像儀處理結(jié)果。

3?注意事項

3.1?瓊脂糖凝膠需要現(xiàn)用現(xiàn)配，最好不要用之前配好的。

3.2?跑電泳時是由負極跑向正極，由黑跑向紅，不要弄反了。

3.3?做實驗時需要戴手套穿實驗服，保護自己的同時也以防樣品被污染。

3.4?移液槍使用之后需要調(diào)到最大量程，以免損壞移液槍。

3.5?電泳儀使用完畢之后需要關(guān)開關(guān)、把電源拔了。

4?儀器圖片

以下為我們實驗室用的儀器器材，其他的一樣效果的儀器器材也是可以的。