通路富集分析方法已經(jīng)是生物學(xué)功能分析中非常有效的手段，通過利用富集算法如超幾何分布，fisher精確檢驗(yàn)等可以獲得與表型顯著相關(guān)的生物學(xué)通路。然而幾乎所有的富集工具所利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法都是從通路基因與表型相關(guān)基因之間的重合率或關(guān)聯(lián)度來評(píng)價(jià)通路的重要性的，通常我們通過顯著性P值來進(jìn)行評(píng)估。然而在生物學(xué)角度講，盡管一些基因富集到了通路中，但是這些基因本身有著不同程度的差異表達(dá)，即有些基因異常變化程度很高，體現(xiàn)出與表型的高度關(guān)聯(lián)性，而有些基因盡管差異表達(dá)，但是差異程度不明顯，很可能是受到關(guān)鍵基因誘導(dǎo)發(fā)生共表達(dá)，或噪音干擾造成的。因此在評(píng)價(jià)一個(gè)通路與表型變化是否相關(guān)的過程中，除了基因數(shù)目的影響，我們也應(yīng)該考慮基因自身表達(dá)情況的差異。

本代碼充分考慮了基因本身的差異表達(dá)程度（pvalue值），利用逆累計(jì)分布函數(shù)將其轉(zhuǎn)化為Z值，通過算法得到通路在這些差異表達(dá)基因的差異表達(dá)下的偏差值，以挖掘顯著偏差的通路以及對(duì)通路的顯著偏差做出最大貢獻(xiàn)的差異表達(dá)基因集合。

只需要基因表達(dá)譜、樣本分組文件及通路富集結(jié)果，軟件將自行計(jì)算出差異表達(dá)基因及相應(yīng)的p.value值，同時(shí)挖掘出實(shí)驗(yàn)條件或疾病狀態(tài)下顯著偏差的通路以及對(duì)通路的顯著偏差做出最大貢獻(xiàn)的差異表達(dá)基因集合。

使用方法：

Rscript ? pathway_score.r ?-exp= ?-group= ?-lfc= ?-KEGG_pathway=

參數(shù)說明：

USAGE:

USAGE:

pathway_score.r -exp=-group=-lfc=-KEGG_pathway=

PARAMETERS:

-exp ? ?the matrix of gene expression ,input csv format.

-group ?the group of sampple ,input txt format,"group" column must exsist.

-KEGG_pathway ? the KEGG pathway that DEGs were enriched,input txt format.

-lfc ? ?the cutoff of logFC.default:1

操作步驟：

1、打開命令行界面，輸入“Rscript pathway_score.r”調(diào)閱幫助文檔，確定該程序所需的輸入文件。

2、用戶根據(jù)幫助文檔中的參數(shù)說明內(nèi)容，對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。這里，必須輸入?yún)?shù)有3個(gè)，分別是-exp，表示基因表達(dá)矩陣文件，這里必須保存為csv格式；-group表示樣本分組文件，輸入格式為txt文本文件，并且必須包含group列且順序一定要和基因表達(dá)矩陣列對(duì)應(yīng)，相應(yīng)的分組這里必須設(shè)置為“Tumor”，“Normal”，如需修改，需進(jìn)入程序源代碼進(jìn)行相應(yīng)修改。-KEGG_pathway表示通路富集結(jié)果文件，這里默認(rèn)的是用clusterProfiler跑出來的結(jié)果，要用到p.adjust列。

可選參數(shù)有1個(gè)，為-lfc，表示差異分析設(shè)置的logFC閾值，默認(rèn)為1，需要注意的是，一旦這里的值發(fā)生變化，相應(yīng)的-KEGG_pathway也需要重新輸入，因?yàn)槭遣町惢蚋患降耐贰?/p>

3、完成參數(shù)提交后，按下回車鍵，整個(gè)程序即正式開始進(jìn)入執(zhí)行。每步執(zhí)行內(nèi)容都會(huì)給出提示。程序執(zhí)行完畢后，界面會(huì)顯示”Program execution is completed"結(jié)束語。

結(jié)果展示：

diff.xls（所有基因差異分析結(jié)果）

logFC：差異表達(dá)倍數(shù)的log2值

AveExpr：基因在所有樣本表達(dá)均值

t：limma包采用t檢驗(yàn)的t統(tǒng)計(jì)值

p.value：顯著性p值

adj.P.Val:經(jīng)過BH校正后P值

B：該基因差異表達(dá)的概率，越大，差異表達(dá)概率越大

diff_exp.xls（按照所設(shè)閾值得到的差異基因表達(dá)矩陣文件）

result.txt（通路偏差得分結(jié)果）

第一列表示通路名稱，第二列表示校正后的通路偏差得分，越高表示該通路偏離正常水平越明顯，與表型越相關(guān)，第三列表示原來富集分析的p.value值，第四列表示對(duì)該條通路貢獻(xiàn)最大的基因個(gè)數(shù)，第五列表示最大貢獻(xiàn)的基因集合

PCA.pdf(基于表達(dá)譜矩陣?yán)L制的PCA圖)

不同形狀和顏色分別表示不同分組

pheatmap.pdf（差異基因雙向?qū)哟尉垲悷釄D）

頂部橫條不同樣色表示不同分組，縱向表示樣本，橫向表示基因，基因表達(dá)越高，顏色越紅

volcano.pdf（火山圖）

差異基因火山圖（藍(lán)色表示下調(diào)基因，紅色表示上調(diào)基因，灰色表示差異不顯著基因）

通路偏差得分富集結(jié)果圖，條形長(zhǎng)度表示最大貢獻(xiàn)基因個(gè)數(shù)多少，縱坐標(biāo)表示通路名稱，顏色越深，表示偏離正常水平越明顯

特別說明：本代碼經(jīng)申請(qǐng)軟件著作權(quán)，僅轉(zhuǎn)讓使用權(quán)，不轉(zhuǎn)讓所有權(quán)

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寫在文末：

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