定期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有益于心血管健康，并能有效降低罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。環(huán)狀RNA（circRNA）在心臟病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。然而，circRNA 在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中的作用以及運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心臟保護(hù)的生物機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探索。

2023年10月28日，上海大學(xué)附屬南通第六人民醫(yī)院和上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院肖俊杰教授團(tuán)隊(duì)在Cardiovascular Research(IF=10.8)發(fā)表文章"Exercise-induced circular RNA circUtrn is required for cardiac physiological hypertrophy and prevents myocardial ischemia-reperfusion injury"。本研究表明環(huán)狀RNA circUtrn是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)生理性心肌肥厚發(fā)展所必需的，抑制CircUtrn可消除運(yùn)動(dòng)對(duì)I/R重構(gòu)的保護(hù)作用。此外，circUtrn過(guò)表達(dá)可防止心肌I/R誘導(dǎo)的急性損傷和病理性心臟重構(gòu)。本研究結(jié)果表明，circUtrn升高及其對(duì)I/R損傷的保護(hù)作用可能對(duì)I/R損傷和病理心臟重構(gòu)具有治療前景。

“

成年小鼠心肌細(xì)胞游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中環(huán)狀RNA表達(dá)的鑒定

作者首先通過(guò)4周游泳訓(xùn)練小鼠，構(gòu)建運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚模型，然后收集成年小鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行RNA測(cè)序并分析circRNA的表達(dá)。選擇了9個(gè)差異顯著的circRNA，并分析它們?cè)?個(gè)病理性心臟模型中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circRNA_0191，專(zhuān)門(mén)參與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心臟生長(zhǎng)，命名為circUtrn進(jìn)一步分析（圖1A-C）。

通過(guò)circBank數(shù)據(jù)庫(kù)集和序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)circUtrn在人類(lèi)和小鼠之間高度保守（補(bǔ)充圖S2）。特異性PCR產(chǎn)物可通過(guò)不同的引物從cDNA中擴(kuò)增，但不能從gDNA中擴(kuò)增。此外，Sanger測(cè)序證實(shí)了circUtrn的反向剪接位點(diǎn)。RNase R和放線菌素D驗(yàn)證了circUtrnR的穩(wěn)定性。RT-qPCR發(fā)現(xiàn)circUtrn在小鼠心臟中含量非常豐富。RNA 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)表明circUtrn 主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1 D-I）。

另外，在游泳訓(xùn)練小鼠的心肌成纖維細(xì)胞中，circUtrn的表達(dá)水平?jīng)]有變化，表明circUtrn可能在心肌細(xì)胞中發(fā)揮特異性作用（圖1J）。為了驗(yàn)證與人類(lèi)的相關(guān)性，作者檢測(cè)了籃球運(yùn)動(dòng)員在急性和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間的血清中circUtrn的表達(dá)。與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)員的血清circUtrn水平顯著升高，表明血清circUtrn水平與耐力訓(xùn)練呈正相關(guān)（圖1K）。綜上所述，circUtrn是一種保守的circRNA，在心肌組織中高表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后在心肌細(xì)胞中特異性上調(diào)。

circUtrn調(diào)控hESC-CMs的肥大和細(xì)胞凋亡

為了研究circUtrn在心肌細(xì)胞中的作用，作者首先構(gòu)建了circUtrn過(guò)表達(dá)（circUtrn OE）和敲低（sh-circUtrn）模型，在circUtrn OE后，H9人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（hESC-CMs）的細(xì)胞大小在基礎(chǔ)水平上增加，而sh-circUtrn則相反（圖2C）。此外，circUtrn OE增強(qiáng)了hESC-CMs的DNA復(fù)制和細(xì)胞周期活性（Ki67染色，pHH3染色），而sh-circUtrn則降低了其活性（圖2C-D）。TUNEL染色表明，circUtrn OE可抑制OGD/R誘導(dǎo)的hESC-CMs細(xì)胞凋亡，sh-circUtrn和OGD/R處理促進(jìn)hESC-CMs凋亡（圖2E）。同時(shí)，Bax是促凋亡調(diào)節(jié)因子，而B(niǎo)cl2是抗凋亡調(diào)節(jié)因子。Bax/Bcl2也證實(shí)了circUtrn對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用（圖2F）。綜上所述，circUtrn調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。

circUtrn是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心臟肥大所必需的

為了進(jìn)一步探索運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥大過(guò)程中心臟circUtrn升高的體內(nèi)影響，作者構(gòu)建了腺相關(guān)病毒血清型9（AAV9）介導(dǎo)的sh-circUtrn（AAV9-sh-circUtrn）和對(duì)照（AAV9-shScramble），隨后通過(guò)尾靜脈注射到成年小鼠體內(nèi)。AAV9給藥一周后，小鼠被隨機(jī)分配到游泳訓(xùn)練組或久坐組（對(duì)照組）。游泳訓(xùn)練的持續(xù)時(shí)間為4周，以誘導(dǎo)生理性心肌肥厚（圖3A）。經(jīng)AAV9-sh-circUtrn處理后，小鼠心臟中circUtrn的表達(dá)受到抑制（圖3B）。通過(guò)對(duì)心臟形態(tài)、心臟重量（HW）和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度（HW/TL）的測(cè)量，circUtrn敲低抑制了心肌肥厚的發(fā)展（圖3C）。接下來(lái)，小麥胚芽凝集素（WGA）染色發(fā)現(xiàn)與接受AAV9-shScramble治療的小鼠相比，下調(diào)circUtrn降低了心肌細(xì)胞的橫截面積（圖3D）。此外，通過(guò)α-actinin與EdU、Ki67和pHH3共免疫熒光染色，表明AAV9-sh-circUtrn處理的訓(xùn)練小鼠心肌細(xì)胞顯示較低的增殖標(biāo)志物表達(dá)水平（圖3E）。綜上所述，circUtrn是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥大發(fā)展所必需的。

circUtrn過(guò)表達(dá)可防止缺血再灌注誘導(dǎo)的病理心臟重構(gòu)

為了探討circUtrn升高對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是否也存在于動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)RT-qPCR表明，急性心肌缺血再灌注（I/R）損傷心臟中circUtrn表達(dá)下調(diào)。隨后，作者構(gòu)建了circUtrn過(guò)表達(dá)AAV9（AAV9-OE-circUtrn），并通過(guò)尾靜脈注射給成年小鼠，七天后進(jìn)行I/R處理。circUtrn（TTC）染色證明，在急性I/R損傷的心臟中，梗死面積顯著縮小。此外，TUNEL染色和Western-blot分析（Bax/Bcl2）顯示，circUtrn過(guò)表達(dá)抑制急性I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖S7A-F）。綜上所述，circUtrn過(guò)表達(dá)可通過(guò)降低心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡來(lái)減少急性I/R損傷。

為了進(jìn)一步探究circUtrn過(guò)表達(dá)對(duì)I/R誘導(dǎo)的病理性心臟重構(gòu)的有益影響。作者在小鼠心臟中過(guò)表達(dá)了 circUtrn。注射AAV9 七天后，分別進(jìn)行了I/R和sham手術(shù)（圖4A）。I/R術(shù)后3周的心臟超聲心動(dòng)圖顯示，與對(duì)照組小鼠相比，過(guò)表達(dá)circUtrn的小鼠心臟的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（FS）更高（圖4C）。WGA染色顯示，心肌細(xì)胞間因不良的 I/R 重構(gòu)而出現(xiàn)的更大的間質(zhì)空間被 AAV9-OE-circUtrn 給藥所抑制（圖4D）。此外，circUtrn 的過(guò)表達(dá)還能減輕 I/R 重構(gòu)誘導(dǎo)的心臟纖維化，且纖維化相關(guān)基因和肥大基因的表達(dá)減少（圖4 E-F）。綜上所述，circUtrn過(guò)表達(dá)可改善I/R重構(gòu)誘導(dǎo)的心功能障礙，并減輕心臟纖維化 。

circUtrn降低可抑制運(yùn)動(dòng)對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的病理性心臟重構(gòu)的保護(hù)作用

運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟功能的好處已經(jīng)被公認(rèn)。因此，作者進(jìn)一步確定circUtrn是否對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的病理性心臟重構(gòu)的保護(hù)作用。通過(guò)尾靜脈注射給予AAV9-sh-circUtrn或AAV9-sh Scramble治療7天后，成年小鼠接受4周的游泳訓(xùn)練（與4周的久坐對(duì)照）以誘導(dǎo)生理性心肌肥大。然后，小鼠被隨機(jī)分配到I/R手術(shù)和sham手術(shù)。在I/R重構(gòu)后3周，與久坐對(duì)照組相比，游泳訓(xùn)練小鼠的心臟功能顯著改善，而AAV9-sh-circUtrn處理的小鼠心臟功能下降（圖5B）。與 AAV9-shScramble 處理的小鼠相比，AAV9-sh-circUtrn 處理的對(duì)照組小鼠在I/R重構(gòu)3周后，心臟功能出現(xiàn)惡化，這表明circUtrn在應(yīng)激刺激下具有額外的保護(hù)作用（圖5B）。sham手術(shù)組游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)circUtrn的上調(diào)影響在sham手術(shù)3周后恢復(fù)到基線，而與久坐對(duì)照組心臟相比，游泳運(yùn)動(dòng)組心臟的 RNA 水平在 I/R 3周后保持不變（圖5C和補(bǔ)充圖 S8）。Masson三色染色表明接受運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠的心臟顯示出心臟纖維化減少，而AAV9-sh-circUtrn減弱了這些保護(hù)作用，久坐對(duì)照組的AAV9-sh-circUtrn治療的小鼠在I/R重構(gòu)期間出現(xiàn)了嚴(yán)重的心臟纖維化（圖5D）。此外，與久坐不動(dòng)的對(duì)照組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠的纖維化基因的表達(dá)降低，而AAV9-sh-circUtrn治療部分降低了這些作用（圖5E）。綜上所述，在缺血再灌注損傷的體內(nèi)模型中，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的circUtrn升高具備對(duì)病理心臟重構(gòu)的保護(hù)作用。

circUtrn與PP5相互作用，并以泛素-蛋白酶體依賴的方式促進(jìn)PP5的降解，從而激活MAPK/ERK信號(hào)通路

作者接著研究了 circUtrn 參與心肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。作者使用生物素標(biāo)記的線性化的環(huán)狀鏈和反義鏈從小鼠心臟裂解液中提取蛋白質(zhì)，以拉下結(jié)合蛋白。隨后質(zhì)譜檢測(cè)、Western blot發(fā)現(xiàn)circUtrn與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶5（PP5）結(jié)合（圖6A-B）。同樣在AC16心肌細(xì)胞中驗(yàn)證了circUtrn與PP5存在相互作用（圖6D）。此外，通過(guò) RIP分析，證實(shí)了circUtrn與PP5的結(jié)合（圖6E）。綜上所述，PP5可以在心肌細(xì)胞中特異性地結(jié)合circUtrn。

在心臟中，PP5在衰竭的心臟中增加，在游泳訓(xùn)練誘導(dǎo)的心肌肥大小鼠中，PP5的表達(dá)顯著降低。相反，在經(jīng)歷I/R重構(gòu)（I/R 3w）的小鼠中，其表達(dá)被升高（補(bǔ)充圖S10B）。另外，circUtrn在小鼠心臟和hESC-CMs的蛋白水平上負(fù)調(diào)控PP5的表達(dá)，而在PP5 mRNA水平上沒(méi)有顯著差異（圖6F）。

PP5可使Raf1去磷酸化，從而調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號(hào)通路，而ERK1/2的激活可抑制心肌細(xì)胞凋亡。在hESC-CMs和小鼠心臟中，過(guò)表達(dá)circUtrn導(dǎo)致PP5水平下降，從而導(dǎo)致Raf1和ERK1/2的磷酸化水平顯著增加（圖6G）。接下來(lái)，通過(guò)使用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理過(guò)表達(dá)或正常的AC16心肌細(xì)胞，并確定PP5降解的時(shí)間過(guò)程。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circUtrn顯著降低了PP5的穩(wěn)定性（圖6H）。

在腎癌中，PP5可被連接酶泛素化，隨后被蛋白酶體降解。所以作者接著研究了泛素蛋白酶體途徑是否參與了circUtrn介導(dǎo)的PP5在心肌細(xì)胞降解。PP5免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，在過(guò)表達(dá)circUtrn的心肌細(xì)胞中，泛素化的PP5增加（圖6I）。而用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，能夠減弱了circUtrn過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的PP5泛素化降解（圖6J）。此外，通過(guò)生物素標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄circUtrn片段，RNA pulldown進(jìn)一步證實(shí)了預(yù)測(cè)的相互作用（圖6K）。同時(shí)，RIP實(shí)驗(yàn)表明只有完整的PP5結(jié)構(gòu)能夠充分結(jié)合circUtrn，而其他突變體結(jié)構(gòu)不能免疫沉淀circUtrn。綜上所述，circUtrn在心肌細(xì)胞中與PP5結(jié)合，并以蛋白酶體依賴的方式促進(jìn) PP5的降解，從而激活MAPK/ERK信號(hào)通路。

過(guò)表達(dá)PP5逆轉(zhuǎn)了circUtrn對(duì)hESC-CMs的調(diào)控作用

作者進(jìn)一步探討了PP5是否參與了circUtrn在hESC-CMs中的調(diào)控作用。在基礎(chǔ)水平上，PP5過(guò)表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積減小，DNA復(fù)制（EdU）和細(xì)胞周期活性相關(guān)標(biāo)志物（Ki67、pHH3）的表達(dá)減少（圖7A-7B）。重要的是，circUtrn對(duì)hESC-CMs的促肥大和促細(xì)胞周期進(jìn)入效應(yīng)被PP5過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)（圖7A-7B）。此外，過(guò)表達(dá)PP5加劇了OGD/R誘導(dǎo)的hESC-CMs細(xì)胞凋亡，降低了過(guò)表達(dá)circUtrn對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用（圖7C）。綜上所述，PP5作用于circUtrn的下游，介導(dǎo)其調(diào)節(jié)hESC-CMs的生長(zhǎng)和凋亡。

總結(jié)：

本研究確定了一個(gè)保守的circRNA-circUtrn，它在運(yùn)動(dòng)的小鼠心肌細(xì)胞中顯著增加。在體外，circUtrn 的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，并通過(guò)結(jié)合和調(diào)節(jié) PP5 緩解 OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的circUtrn的增加對(duì)于 I/R重構(gòu)環(huán)境下運(yùn)動(dòng)的保護(hù)作用至關(guān)重要。在小鼠心臟中強(qiáng)制過(guò)表達(dá)circUtrn可減少急性心肌 I/R損傷，并防止I/R重構(gòu)。

原文鏈接：

10.1093/cvr/cvad161