1981年, 科學(xué)家成功從新生小鼠頭蓋骨中獲得了成骨細(xì)胞模型--MC-3T3細(xì)胞。這種成骨細(xì)胞系在體外保持了向成骨細(xì)胞分化和礦化的能力，使其成為骨生物學(xué)研究中非常有用的細(xì)胞模型。MC-3T3能夠產(chǎn)生膠原并分化為成骨樣細(xì)胞，在體外和體內(nèi)形成鈣化組織。早期的研究表明，骨組織通過成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收不斷重塑，以維持骨體積和體內(nèi)平衡。因此，骨重建被認(rèn)為是由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞之間的串?dāng)_來調(diào)節(jié)的。MC-3T3細(xì)胞也成為了此類骨相關(guān)研究的重要體外模型。

應(yīng)用：

MC-3T3細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力?；贑RISPR/Cas9的MC-3T3細(xì)胞基因編輯可以加速骨研究。MC-3T3已經(jīng)廣泛應(yīng)用于以下幾類研究：

1.?型膠原蛋白生物合成，這是細(xì)胞外骨基質(zhì)中最重要和最豐富的有機(jī)成分，提供骨骼強(qiáng)度和柔韌性。

2.?WNT信號通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖分化和基質(zhì)礦化而成為骨形成的重要調(diào)節(jié)因子。

3.?轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，骨重建異常，骨轉(zhuǎn)換增加。

4.?成骨細(xì)胞分化，一種調(diào)控成骨細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。功能喪失導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化和骨形成減少。

CRISPR-U? 介導(dǎo)的MC-3T3細(xì)胞的基因編輯

基因編輯和細(xì)胞模型的建立可以促進(jìn)功能基因組學(xué)、信號通路、代謝、細(xì)胞死亡、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物反應(yīng)和癌癥等領(lǐng)域的研究。目前，成骨細(xì)胞模型（MC-3T3）廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分化、旁分泌因子對骨形成或吸收的影響研究。最近的研究發(fā)現(xiàn)，影響骨組織穩(wěn)態(tài)的突變蛋白和新的途徑參與骨骼發(fā)育和維持。為了加速骨生物學(xué)研究，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在MC-3T3細(xì)胞中實現(xiàn)基因組編輯。CRISPR-U?是源井生物獨立研發(fā)的，可用于MC-3T3細(xì)胞快速精確基因編輯的系統(tǒng)。通過CRISPR構(gòu)建的細(xì)胞模型使研究各種骨骼疾病的機(jī)制成為可能，這些疾病主要與骨骼發(fā)育、吸收、骨肉瘤和代謝過程有關(guān)。在闡明致病機(jī)制的基礎(chǔ)上，這些細(xì)胞模型可以與藥物篩選和其他治療研究相結(jié)合。

案例分析

利用CRISPR介導(dǎo)的基因敲除MC-3T3，發(fā)現(xiàn)一種預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥的新途徑:

骨質(zhì)疏松癥是一個巨大且日益嚴(yán)重的公共健康問題。骨質(zhì)疏松癥以低骨量和骨微結(jié)構(gòu)缺陷為特征，導(dǎo)致骨折的易感性增加。骨骼健康的維持有賴于骨吸收的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)和平衡作用，從而實現(xiàn)骨骼的凈平衡。因此，臨床上需要尋找新的治療骨質(zhì)疏松癥的分子靶點，特別是那些在刺激骨形成的同時抑制骨吸收的分子靶點。維甲酸受體相關(guān)孤兒受體β（Rorβ）是一種新的成骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在從老年骨質(zhì)疏松小鼠分離的骨髓源性骨祖細(xì)胞中Rorβ的表達(dá)高度升高，提示Rorβ在介導(dǎo)年齡相關(guān)性骨丟失中的潛在作用。在成骨前小鼠細(xì)胞系MC-3T3中的過度表達(dá)研究表明，已知的成骨途徑有顯著的調(diào)節(jié)作用，支持Rorβ調(diào)節(jié)成骨的關(guān)鍵作用。研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)證明，成骨細(xì)胞中Rorβ的丟失增強(qiáng)了Wnt信號傳導(dǎo)，特別是通過在Wnt靶基因Tcf7和Opg的啟動子中增加β-catenin對T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（Tcf/Lef）DNA結(jié)合位點的招募。因此，通過增加Rorβ缺陷MC-3T3細(xì)胞中骨保護(hù)素（OPG）的分泌，增加成骨基因的表達(dá)并抑制破骨細(xì)胞的形成。

CRISPR介導(dǎo)的Rorβ突變體的構(gòu)建及基因表達(dá)分析：

Rorβ基因有兩個亞型（Rorβ1和Rorβ2），其中Rorβ2亞型不可檢測。因此，Rorβ1是Rorβ基因的代表。Rorβ1的ATG起始密碼子位于外顯子1的3′端，因此，靶向外顯子2進(jìn)行基因編輯。設(shè)計3個gRNA，在測試編輯效率后，選擇一個gRNA刪除MC-3T3細(xì)胞中的Rorβ。用非特異性gRNA產(chǎn)生的對照細(xì)胞系MC3T3-Cont。mc3t3drorβ細(xì)胞系的克隆和序列分析顯示，小鼠Rorβ等位基因存在1堿基對（bp）和4-bp缺失，導(dǎo)致移碼突變，最終導(dǎo)致無功能等位基因。為了分析Rorβ缺失對成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響，從成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ細(xì)胞中采集不同時間點的RNA樣本。QPCR分析顯示骨標(biāo)記基因在MC3T3-DRorβ細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。

圖1:CRISPR/Cas9在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中Rorβ缺失。（A）顯示了小鼠Rorβ基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)。（B）用CRISPR/Cas9基因編輯方法對小鼠Rorβ基因第2外顯子（大寫）進(jìn)行了突變。用于靶向等位基因的gRNA序列以黃色突出顯示。（C-G）兩種細(xì)胞模型用成骨培養(yǎng)基處理，并在第0-10天（n=6）采集供骨標(biāo)志物進(jìn)行qPCR。

Rorβ缺陷成骨細(xì)胞通過β-catenin依賴機(jī)制顯示增強(qiáng)的Wnt信號：

突變的MC3T3-DRorβ細(xì)胞被用來識別典型細(xì)胞通路的改變。他們觀察到Wnt/β-catenin通路的顯著改變，以及MC3T3-DRorβ細(xì)胞中調(diào)節(jié)該通路的幾種已知的調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。IPA分析顯示T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（Tcf/Lef）DNA結(jié)合位點顯著富集。這些結(jié)果表明，成骨細(xì)胞中Rorβ的丟失導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的改變。RNAseq證實了兩個著名的Wnt靶基因Opg和Tcf7，并觀察到該基因在Rorβ缺陷細(xì)胞中的表達(dá)在整個時間過程中顯著上調(diào)。Wnt通路在Rorβ缺陷成骨細(xì)胞Opg和Tcf7上調(diào)中的作用，使用DKK1或JW55進(jìn)行的一系列抑制劑研究發(fā)現(xiàn)Wnt通路因Rorβ的丟失而改變。

圖2:Rorβ調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin通路。（A，B）RNAseq和IPA分析鑒定的Wnt/βcatenin調(diào)控基因在MC3T3 DRorβ中有顯著調(diào)控。（C，D）重新查詢和分析圖1中的時間進(jìn)程，以獲得Opg和Tcf表達(dá)式。（E，F(xiàn)）MC3T3-Cont和MC3T3-D Rorβ細(xì)胞系在合流處用成骨培養(yǎng)基處理，然后補充Dkk1（200ng/mL）、JW55（10mM）或兩者兼用；48小時后取細(xì)胞，并對Opg和Tcf7進(jìn)行qPCR（n=6）。

Rorβ缺陷細(xì)胞通過產(chǎn)生OPG抑制破骨細(xì)胞的形成:

對MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ細(xì)胞進(jìn)行芯片檢測，以了解β-catenin調(diào)控Opg和Tcf7基因的機(jī)制。研究人員發(fā)現(xiàn)，在Rorβ缺陷細(xì)胞中，位于Opg和Tcf7基因啟動子內(nèi)的Tcf/Lef DNA結(jié)合位點的β-catenin和RNA聚合酶（RNAP）募集增加。他們驗證了Rorβ抑制了TOP-FLASH Wnt報告結(jié)構(gòu)中組成活性形式β-catenin（ca-βcat）的轉(zhuǎn)錄活性。因此，他們得出結(jié)論，Rorβ通過抑制成骨細(xì)胞Wnt反應(yīng)基因啟動子中Tcf/Lef結(jié)合位點的β-catenin募集來抑制Wnt活性。他們評估了OPG增加對破骨細(xì)胞生成的影響。他們發(fā)現(xiàn)Rorβ缺陷細(xì)胞能夠通過增加OPG的產(chǎn)生和分泌來抑制破骨細(xì)胞的生成。

圖3:Rorβ-缺失增強(qiáng)了β-catenin向Wnt反應(yīng)基因啟動子的募集。（A–D）在用10 ng/mL Wnt3a或未經(jīng)處理（基礎(chǔ)）6小時后，對MC3T3 Cont和MC3T3 DRorβ細(xì)胞系進(jìn)行芯片分析。對Opg和Tcf7基因啟動子中的β-catenin、RNAP和QPCR進(jìn)行IPs檢測。這些數(shù)據(jù)是與IgG陰性對照IP相關(guān)的。（E）Ca-βcat和TOP-FLASH共轉(zhuǎn)染-/+Rorβ，48小時后測定熒光素酶活性（n=6）。（F）收集處理細(xì)胞的CM，ELISA法測定OPG蛋白水平。（G）骨髓源性破骨細(xì)胞前體與含1%培養(yǎng)基的破骨細(xì)胞支持培養(yǎng)基孵育。

綜上，Rorβ缺失對骨保護(hù)作用在骨微環(huán)境中引發(fā)多方面的反應(yīng)。Rorβ的缺失通過增加Tcf7和Wnt信號反應(yīng)來促進(jìn)骨形成。同時，Rorβ缺失通過增加OPG的產(chǎn)生和分泌來影響骨吸收，從而減少破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞活性?？偟膩碚f，增加骨形成和減少骨吸收是預(yù)防骨丟失的結(jié)果。抑制Rorβ可能是防治骨質(zhì)疏松癥的新途徑。

CRISPR-U? 高效修飾MC-3T3細(xì)胞系基因

CRISPR-U? 是源井生物自主研發(fā)的細(xì)胞系基因編輯技術(shù)。通過對基因編輯載體和過程的優(yōu)化，提高了CRISPR-U基因切割、重組的效率，是傳統(tǒng)基因編輯的十倍。我們可以根據(jù)您的需求定制基因編輯MC-3T3細(xì)胞系，滿足基因編輯的各種需求。為您提供基于敲除、敲除和點突變的MC-3T3模型細(xì)胞，助力骨生物學(xué)相關(guān)的研究。

References:

1. Osteoprotection Through the Deletion of the Transcription Factor Rorb in Mice. Journal of Bone and Mineral Research, 33(4) 2018, 720–731.

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。

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