01 實驗背景介紹

實時活細(xì)胞成像是研究細(xì)胞動態(tài)的首選方法， 貼壁細(xì)胞由于他們移動速度緩慢實現(xiàn)實時追蹤并不成問題，然而懸浮細(xì)胞，如造血干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞， 由于他們遷移迅速會很快離開視野使得實時追蹤懸浮細(xì)胞充滿了挑戰(zhàn)。

除此之外，大多數(shù)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)為了實現(xiàn)對細(xì)胞的實時追蹤需要對細(xì)胞進(jìn)行染色或使用熒光標(biāo)記，而這些方法都可能通過某種不受控制的方式激活細(xì)胞而影響研究的生理相關(guān)性（Gilner et al，2007）。

為了更好地同時解決這兩個問題，Daniel Day（Day et al，2009）開發(fā)了一種使用無涂層的硅樹脂微格（microgrid）來對懸浮細(xì)胞進(jìn)行成像。這些微細(xì)網(wǎng)格不會對細(xì)胞造成任何傷害或影響，并且這些微格設(shè)置了60um的網(wǎng)格壁可以框住懸浮細(xì)胞，可以在不限制細(xì)胞運動和細(xì)胞間相互作用的前提下防止細(xì)胞逃出視野，從而實現(xiàn)對懸浮細(xì)胞的實時追蹤。

這篇文章詳細(xì)展示了Daniel如何利用活細(xì)胞成像系統(tǒng)HoloMonitor M4以無標(biāo)簽的方式研究臍帶血衍生的CD34+細(xì)胞對細(xì)胞因子刺激的動態(tài)變化。

02 材料和方法

細(xì)胞分離和培養(yǎng)

人類臍帶血（UCB）使用autoMACS pro (Miltenyi Biotec, France)通過免疫磁選分離出人類CD34+細(xì)胞，該磁選基于UCB樣本單核細(xì)胞部分的人類CD34表達(dá)。

微格準(zhǔn)備

一個由聚二甲基硅氧烷（PDMS--生物相容性硅膠）制成的含有1024個微孔（125微米寬，60微米深）的微格（Microsurfaces，澳大利亞）被放置在一個無涂層的35毫米培養(yǎng)皿中，底部為聚合物蓋玻片（圖1）。用鑷子將微網(wǎng)從其支架上剝離，直接放在在培養(yǎng)皿中。在微網(wǎng)格上加入200ul100%的酒精消毒5分鐘。然后移出酒精并將微格在通風(fēng)櫥中晾曬30分鐘。然后將五千個細(xì)胞加到網(wǎng)格中并放置10分鐘進(jìn)行沉淀。根據(jù)泊松定律，大約有30%的微格中只含有一個細(xì)胞。

實時成像

作者用HoloMonitor M4在培養(yǎng)箱中對細(xì)胞進(jìn)行實時成像， 作者一共選取了20個位點，每個位點覆蓋4個微孔，每10分進(jìn)行一次成像并持續(xù)4天。之后用HoloMonitor App Suite軟件處理圖像并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)在用R處理細(xì)胞參數(shù)偏心率和運動性后用于制圖。參數(shù)偏心率描述了細(xì)胞偏離圓形的程度。0的值對應(yīng)于一個圓，細(xì)胞越細(xì)長，偏心率值就越高，接近1。運動性參數(shù)給出了細(xì)胞在細(xì)胞路徑的起點和終點之間的實際距離。

03 實驗結(jié)果

形態(tài)學(xué)測定

以前的研究已經(jīng)證明，細(xì)胞形態(tài)和CD34+細(xì)胞的分化潛力之間存在著緊密的聯(lián)系。在CD34+臍帶血細(xì)胞部分已經(jīng)描述了兩種主要的形態(tài)形式。具有阿米巴形狀的極化細(xì)胞能夠通過劇烈的形狀變化進(jìn)行主動運動，通常在一端擁有一個被稱為尿囊的大突起。這些細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)保留了原始的自我更新和干細(xì)胞功能（Gorgens et al，2014）。第二種形態(tài)類型是圓形。這些細(xì)胞已經(jīng)被認(rèn)為是已經(jīng)參與了分化（Wagner et al，2004）。

用Holomonitor M4獲得的圖像可以很容易地觀察到之前描述的兩種細(xì)胞形態(tài)。從隔離和操作的壓力中恢復(fù)后，創(chuàng)始細(xì)胞（即最初被放入微網(wǎng)格的細(xì)胞）在幾小時內(nèi)獲得了極化的形態(tài)，發(fā)展出尿囊并開始了主動運動階段（圖2）。

運動性和偏心率的量化

為了說明該系統(tǒng)量化細(xì)胞形狀和運動的能力，作者監(jiān)測了細(xì)胞的運動性和偏心率。極化的細(xì)胞往往有很強的運動能力，而圓形的細(xì)胞則表現(xiàn)出低的運動能力。對偏心率的量化也很好的幫助區(qū)分這兩種形態(tài)（極化與圓形）。圖3展示了這兩種細(xì)胞形態(tài)在行為上的差異，在四個小時的監(jiān)測中，平均偏心率為0.36±0.15的圓形細(xì)胞顯示出低運動性，其運動軌跡不超過100微米，僅限于微孔上角的一個非常小的區(qū)域。而鄰近的微孔中的極化細(xì)胞顯示出寬闊的軌跡，幾乎覆蓋了40%的微孔表面面積，運動能力攀升至600微米，而其偏心率平均為0.72±0.12（圖3C）。

細(xì)胞在前96小時內(nèi)的生長情況

CD34人類臍帶血細(xì)胞延遲成像

細(xì)胞的干質(zhì)量可以通過定量相位成像來確定（Barer 1952，Acnou et al，2015）。溶液的折射率被證明是溶劑折射率和與溶質(zhì)質(zhì)量密度成比例的增量之和。作者應(yīng)用這種測量技術(shù)來區(qū)分第一代與第二代的細(xì)胞生長演變（圖4），而這種方法的優(yōu)點是可以避免對樣品的使用任何的標(biāo)記或進(jìn)行染色。

結(jié)果顯示，第一代與第二代相比，細(xì)胞衰老過程明顯不同。此外，HoloMonitor M4系統(tǒng)使我們能夠根據(jù)光學(xué)體積來量化大量細(xì)胞的干質(zhì)量，證明與第一代相比，分裂時間的縮短與生長的差異較小有關(guān)（圖4 C）。

04 實驗討論

在這份報告中，我們展示了搭配微格搭配活細(xì)胞成像系統(tǒng)在單細(xì)胞水平上跟蹤懸浮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運動和細(xì)胞生長的可行性。

HoloMonitor M4采用的全息成像是一種無標(biāo)簽的方法，因此避免了任何可能改變細(xì)胞的標(biāo)簽，特別是造血性CD34+干細(xì)胞（Gilner et al，2007）。而微網(wǎng)格陣列和定量實時成像的結(jié)合，克服了追蹤懸浮細(xì)胞有可能離開視野造成的實時追蹤的困難。

與傳統(tǒng)方法相比，使用HoloMonitor M4的強大優(yōu)勢之一是易于量化關(guān)鍵參數(shù)，如可直接量化與細(xì)胞生長相關(guān)的光學(xué)體積。此外，它還提供了捕捉細(xì)胞亞群（如垂死細(xì)胞）中罕見事件的可能性。這種方法的總體優(yōu)勢是，由于自動圖像分析只需要少量的人工修正，因此大大節(jié)省了時間，準(zhǔn)確估計了細(xì)胞的干質(zhì)量，并可以同時研究不同的條件。

作者在本報告中表明，活細(xì)胞成像系統(tǒng)結(jié)合微細(xì)網(wǎng)格為懸浮細(xì)胞的單細(xì)片上分析鋪平了道路。此外，作者所展示的監(jiān)測細(xì)胞運動和軌跡模式的能力對許多基礎(chǔ)研究領(lǐng)域或?qū)?xì)胞運動起關(guān)鍵作用的疾病研究，如轉(zhuǎn)移性癌癥疾病，提供了更多的可能性。

05 參考文獻(xiàn)

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