糖尿病（Diabetes mellitus）顧名思義，尿液中含有糖分，患病者容易出現(xiàn)消瘦和口渴癥狀，我國古代又稱其為“消渴癥”。是一種慢性、代謝性、非傳染性疾病，主要表現(xiàn)為“三多一少”，即多飲、多尿、多食和體重下降，當胰腺胰島素分泌不足或機體無法有效利用胰島素時，機體就會出現(xiàn)糖尿病。長期糖尿病會導致心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能改變，而這些改變與心肌缺血或微血管粥樣硬化等疾病無關(guān)，這種心肌損傷被稱為糖尿病性心肌病，是糖尿病的常見并發(fā)癥，據(jù)估計，超過三分之一的糖尿病病患最終都會發(fā)展為糖尿病性心肌病。心肌細胞死亡是導致糖尿病心肌損傷的核心事件，然而病患心肌細胞死亡的具體機制在很大程度上卻仍然未可知。

2022年11月30日，復旦大學附屬中山醫(yī)院鄒云增教授、葛均波院士及復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院李立亮副教授合作在《Circulation》（IF=37.8）發(fā)表了題為：“Cannabinoid Receptor 2-Centric Molecular Feedback Loop Drives Necroptosis in Diabetic Heart Injuries”的研究論文，

在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)在糖尿病晚期，細胞壞死性凋亡的激活與心肌損傷息息相關(guān)，大麻素受體2（CB2R）是調(diào)節(jié)壞死性凋亡的關(guān)鍵因子，CB2R抑制轉(zhuǎn)錄因子BACH2 520絲氨酸位點磷酸化，從而導致BACH2易位至細胞核并抑制細胞壞死性凋亡相關(guān)基因激酶受體互作蛋白1（RIP1）、激酶受體互作蛋白3（RIP3）和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶（MLKL）的表達，闡述了糖尿病通過CB2R-BACH2-MLKL引起心肌損傷的新機制，為調(diào)控糖尿病心肌損傷提供了一種有前景的方法。

具體研究內(nèi)容，就讓小編帶大家一起了解一下吧！

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首先作者通過查閱資料發(fā)現(xiàn)糖尿病導致的心肌損傷過程中細胞凋亡和壞死性凋亡是重要原因，因此作者對HG處理的心肌細胞的細胞凋亡和壞死性凋亡水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)無論是原代還是體外培養(yǎng)的小鼠心肌細胞系（HL-1）經(jīng)HG處理后凋亡和壞死性凋亡均可被激活，12-72h內(nèi)細胞凋亡逐漸增強，而72h后凋亡逐漸減弱，磷酸化的RIP1、RIP3和MLKL表達量升高，TNF受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）和死亡域蛋白（FADD）表達量升高，此時壞死性凋亡被激活。掃描電鏡下可見HG刺激72h后細胞破裂，發(fā)生壞死性凋亡，Western Blot結(jié)果也顯示壞死性凋亡普遍發(fā)生在16周齡以上的糖尿病小鼠中。除此之外流式分析、免疫熒光和活細胞實時監(jiān)測結(jié)果也表明，細胞壞死性凋亡主要發(fā)生在糖尿病后期。

圖1 糖尿病心肌損傷后期壞死性凋亡被激活

Nec-1是一種壞死性凋亡抑制劑，為了探究Nec-1抑制壞死性凋亡的治療意義，作者對16周齡db/db小鼠注射Nec-1，超聲心動圖顯示，盡管糖尿病小鼠與對照組相比，心功能顯著受損，但Nec-1注射后心臟受損程度卻得到減輕，心臟重量與脛骨長度的比值降低，F(xiàn)N、白介素6（IL-6）和磷酸化的RIP1、RIP3和MLKL等基因表達水平下降，壞死性凋亡信號通路被阻斷，此種現(xiàn)象證明了在壞死性凋亡發(fā)展階段對糖尿病進行干預可以為心臟提供有效保護。

圖2 Nec-1抑制糖尿病心肌損傷

為探究HG是如何激活壞死性凋亡的，作者使用G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）激動劑添加到HG處理的HL-1細胞中，結(jié)果顯示GPCR中CB2R的激動劑對細胞壞死性凋亡有很好的抑制作用，兩種CB2R激動劑AM1241和JWH-133均能抑制HG誘導的細胞壞死性凋亡，其中JWH-133對細胞壞死性凋亡抑制效果在CB2R過表達后進一步增強，在CB2R敲低后抑制作用減弱。在HL-1細胞中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。然后，作者將CB2R激動劑用于糖尿病小鼠，Western Blot、組織學研究、超聲心動圖結(jié)果均顯示，CB2R激動劑改善了糖尿病小鼠心肌損傷，且伴隨著RIP1、RIP3和MLKL的總蛋白以及磷酸化的蛋白量下降。免疫組化結(jié)果顯示，在糖尿病小鼠心臟中MLKL表達上調(diào)并發(fā)生磷酸化，CB2R激動劑可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。掃描電鏡觀察進一步證實，CB2R激動劑AM1241可恢復HG導致的細胞成團現(xiàn)象。這些結(jié)果均表明，CB2R激動劑可有效抑制糖尿病小鼠心肌細胞壞死性凋亡。

圖3 CB2R有效抑制糖尿病心肌壞死性凋亡

通過RNA-seq作者篩選了可能參與其過程的轉(zhuǎn)錄因子，其中BACH2沉默后逆轉(zhuǎn)了CB2R對細胞壞死性凋亡的抑制作用，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)BACH2上存在2個與RIP1和RIP3啟動子結(jié)合的位點，進一步進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗、定點突變實驗和雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，BACH2可與RIP1和RIP3啟動子的特定區(qū)域結(jié)合抑制靶基因表達，從而抑制細胞壞死性凋亡，后對BACH2進行定位分析，發(fā)現(xiàn)BACH2上游S6激酶（S6K）磷酸化后阻止了BACH2細胞質(zhì)向細胞核中轉(zhuǎn)運，而CB2R抑制S6K蛋白的磷酸化促進BACH2的胞漿轉(zhuǎn)位，維持BACH2發(fā)揮功能，從轉(zhuǎn)錄水平抑制壞死性凋亡通路的激活。

圖4 CB2R調(diào)節(jié)BACH2抑制壞死性凋亡

在體外培養(yǎng)的細胞系中，作者觀察到敲低CB2R通常會促進HL-1壞死性凋亡水平，但是當BACH2過表達后此種現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。因此作者驗證在糖尿病小鼠是否也存在此現(xiàn)象，糖尿病小鼠心臟原位注射AAV9-α-MHC–BACH2以過表達BACH2，觀察到CB2R拮抗劑AM630可加重糖尿病小鼠心肌損傷，但是BACH2過表達小鼠中心臟損傷效果明顯減輕。WB檢測發(fā)現(xiàn)使用AM630后FN、IL-6、RIP1、RIP3和MLKL表達上調(diào)，BACH2過表達后上調(diào)被抑制。免疫熒光染色、組織學檢查結(jié)果也表明，AM630加重了糖尿病引起的炎癥和纖維化，而BACH2可有效緩解心臟損傷。這些現(xiàn)象均表明，抑制CB2R則加重糖尿病心臟損傷，BACH2過表達可以逆轉(zhuǎn)此種現(xiàn)象。

圖5 過表達BACH2抑制CB2R拮抗劑誘導的糖尿病心臟損傷

為進一步探究CB2R調(diào)控BACH2的作用機制，作者構(gòu)建了BACH2敲除的糖尿病小鼠（BACH2-CKO），其FADD、IL-6、α1-1型膠原基因（COL1A1）、RIP1、RIP3和MLKL的總蛋白和磷酸化的蛋白表達量升高。值得注意的是，AM1241抑制細胞壞死性凋亡并導致IL-6和COL1A1表達量降低的現(xiàn)象僅發(fā)生在糖尿病小鼠中，而在BACH2-CKO糖尿病小鼠中則未出現(xiàn)此現(xiàn)象，超聲心動圖和組織學研究結(jié)果也顯示AM1241僅能改善糖尿病小鼠心肌損傷。這些現(xiàn)象表明CB2R改善糖尿病小鼠心肌損傷過程中需要BACH2的存在。

圖6 BACH2敲除加重糖尿病心肌損傷并抑制CB2R對心臟的保護作用

體內(nèi)和體外實驗的結(jié)果表明HG環(huán)境下細胞膜上的CB2R顯著降低，而細胞質(zhì)中CB2R增加，CB2R的含量和活性在很大程度上取決于其亞細胞定位和磷酸化修飾，而CB2R又與絕大多數(shù)GPCR一樣可以結(jié)合β-arrestin 2，因此作者檢測了β-arrostin 2的表達量，發(fā)現(xiàn)早在HG處理后12小時β-arrestin 2開始增加，CB2R開始降低。MLKL是CB2R絲氨酸352（S352）的上游激酶，作者自制了特異性靶向CB2R（S352）位點的磷酸化抗體以檢測p-CB2R表達水平。結(jié)果表明，HG可增加p-CB2R表達水平，降低總CB2R表達水平，MLKL、RIP1或RIP3過表達都可促進HEK-293T細胞中CB2R（S352）位點的磷酸化，而MLKL磷酸化后，會伴隨CB2R泛素化增強。這些結(jié)果表明，MLKL在S352位點使CB2R磷酸化并導致CB2R降解。

圖7 CB2R與β-arrestin 2結(jié)合在S352被磷酸化并在HG環(huán)境下被MLKL降解

收集已故有無糖尿病史的人群心臟樣本，作者分析發(fā)現(xiàn)糖尿病心臟樣本中，CB2R和BACH2顯著降低，而TRADD和FADD顯著增加，心臟伴有明顯的纖維化。免疫組化結(jié)果顯示，糖尿病心臟樣本中CB2R和BACH2蛋白水平顯著降低，而MLKL蛋白水平顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)表明，糖尿病與這些蛋白質(zhì)的表達有關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示人類糖尿病心臟中RIP1、RIP3和MLKL表達量升高，CB2R或BACH2與MLKL表達水平以及心臟纖維化程度呈顯著負相關(guān)。

圖8 CB2R和BACH2與糖尿病心肌損傷呈負相關(guān)

綜上所述，作者證明了壞死性凋亡發(fā)生在糖尿病心肌損傷晚期，CB2R可通過BACH2抑制壞死性凋亡進而緩解糖尿病心肌損傷的進展，而壞死性凋亡通路的效應(yīng)分子MLKL可促進CB2R（S352）位點磷酸化最終導致其降解，這些結(jié)果表明CB2R-BACH2-MLKL形成了一個壞死性凋亡新型環(huán)路，為開發(fā)新的糖尿病心肌損傷干預靶點提供理論支撐。