2019年12月以來，由新冠病毒(SARS-CoV-2)導(dǎo)致的新冠肺炎(COVID-19)在全球蔓延，給人類生命健康帶來了巨大威脅。由于其極快的傳染速度，開發(fā)快速高靈敏的檢測(cè)方法對(duì)病毒的防控至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外已經(jīng)針對(duì)SARS-CoV-2病毒開發(fā)了一系列檢測(cè)方法，其檢測(cè)對(duì)象主要為病毒核酸、病毒抗原及其特異性抗體。在常用的核酸診斷方法中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸擴(kuò)增法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)普遍使用；酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、膠體金免疫層析法等抗原抗體檢測(cè)技術(shù)對(duì)于檢測(cè)新冠病毒也起了非常重要的作用。但是這些方法存在著復(fù)雜的勞動(dòng)密集型步驟，以及時(shí)間(≥1小時(shí))和高成本。因此，方便、快速、經(jīng)濟(jì)、高靈敏度的病毒檢測(cè)仍然是疫情防范的關(guān)鍵技術(shù)障礙。

Human ACE2-Functionalized Gold “Virus-Trap” Nanostructures for Accurate Capture of SARS-CoV-2 and Single-Virus SERS Detection

Yong Yang*, Yusi Peng, Chenglong Lin, Li Long, Jingying Hu, Jun He*, Hui Zeng, Zhengren Huang*, Zhi-YuanLi, Masaki Tanemura, Jianlin Shi, John R. Lombardi*, Xiaoying Luo*

Nano-Micro Letters?(2021)13: 109

本文亮點(diǎn)

1.?介紹了一種超靈敏的COVID-19 SERS生物傳感器，可在單病毒水平上檢測(cè)污染水中的SARS-CoV-2病毒。

2.?SERS傳感器對(duì)模擬污染水中的SARS-CoV-2病毒的檢測(cè)限低至80 copies/mL，時(shí)間短至5分鐘。

3.?ACE2修飾的SERS傳感器結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)得出的鑒定標(biāo)準(zhǔn)能夠快速檢測(cè)未知的新型冠狀病毒。

內(nèi)容簡介

中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所楊勇研究員、黃政仁研究員，與安徽省疾病預(yù)防控制中心、上海交通大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院、華南理工大學(xué)、日本名古屋工業(yè)大學(xué)及美國紐約市立學(xué)院科研人員合作，聯(lián)合開發(fā)了一種新冠病毒表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)傳感器及快速檢測(cè)新技術(shù)，該傳感器具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)功能化的金納米“森林”結(jié)構(gòu)，能夠選擇性捕獲SARS-CoV-2病毒，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了單病毒水平。

借助于該傳感器高靈敏性，該工作首次給出了滅活新冠病毒及其表面刺突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)各自獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)Raman光譜以及峰位歸屬理論分析，對(duì)于SERS研究領(lǐng)域進(jìn)一步開展病毒檢測(cè)研究具有重要指導(dǎo)價(jià)值。并通過機(jī)器學(xué)習(xí)手段建立了病毒信號(hào)診斷標(biāo)準(zhǔn)和方法，其對(duì)SARS-CoV-2病毒最佳檢測(cè)限優(yōu)于100 copies/mL，檢測(cè)時(shí)間少于5分鐘。這對(duì)新冠病毒現(xiàn)場(chǎng)臨床檢測(cè)具有重要意義，同時(shí)該方法有望用于快速建立未來未知冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和高靈敏現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

圖文導(dǎo)讀

I?二維金納米針陣列(GNAs)芯片的制備與表征

采用斜角離子束濺射技術(shù)制備了有序排列的二維金納米針陣列SERS基底，如圖1a-c所示。精心設(shè)計(jì)的具有適當(dāng)斜角和結(jié)構(gòu)參數(shù)的高密度納米針可以形成“病毒陷阱”納米森林，可對(duì)50-100 nm大小的病毒進(jìn)行定位，誘導(dǎo)病毒落入納米針陣列，并通過附著在納米錐體的ACE2受體精準(zhǔn)捕獲SARS-CoV-2病毒，并阻止病毒逃逸。更有趣的是，這些納米針呈現(xiàn)出由許多直徑約為40 nm的小金納米顆粒組成的分級(jí)納米結(jié)構(gòu)。這些尖銳的針尖可以誘發(fā)“避雷針”效應(yīng)，積聚的納米粒子可以表現(xiàn)出“熱點(diǎn)”效應(yīng)，從而協(xié)同增強(qiáng)SERS效果。

圖1. 金納米針陣列的微觀組織結(jié)構(gòu)及病毒蛋白的SERS光譜分析。(a) GNAs的SEM圖；(b) 由傾斜的金納米針陣列構(gòu)成的“病毒陷阱”納米森林示意圖；(c) FDTD計(jì)算的GNAs的電磁場(chǎng)分布圖；(d) SARS-CoV-2 S蛋白、核殼蛋白、SARS-CoV S蛋白、ACE2蛋白的SERS譜圖和示意圖；(e) 計(jì)算的SARS-CoV-2 S蛋白在 Au簇上4種主要個(gè)體氨基酸Tyr、Trp、His、Phe的靜態(tài)拉曼光譜。

II?GNAs芯片的SERS性能

SARS-CoV-2病毒直徑約為100 nm，比常規(guī)SERS可分析的分子要大。在SARS-CoV-2中，SARS-CoV-2病毒被數(shù)十納米大小的S蛋白覆蓋。當(dāng)SARS-CoV-2病毒的表面與金屬納米粒子充分接觸時(shí)，表面S蛋白將處于“熱點(diǎn)”區(qū)域，并產(chǎn)生可檢測(cè)的特征拉曼信號(hào)。因此，SERS檢測(cè)冠狀病毒時(shí)，其拉曼信號(hào)將主要表現(xiàn)為冠狀病毒表面S蛋白的Raman光譜特征。我們初步表征了四種蛋白的SERS光譜，分別是SARS-CoV-2刺突S蛋白、SARS-CoV-2核衣殼N蛋白、SARS-CoV S蛋白和人體ACE2蛋白，如圖1d-e。這四種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出可區(qū)分的拉曼光譜，與計(jì)算光譜分析一致。

III?SARS-CoV-2 S、SARS-CoV S與ACE2的親和力

通過測(cè)量S蛋白與ACE2的結(jié)合時(shí)間來尋找ACE2功能化的SERS芯片完全捕獲SARS-CoV-2病毒的合適時(shí)間。在相同177 nM濃度下，新冠病毒SARS-CoV-2 的刺突S蛋白和SARS的 S蛋白被ACE2功能化的SERS芯片捕獲隨時(shí)間變化的SERS光譜如圖2所示。結(jié)果表明SARS-CoV-2 S與ACE2結(jié)合的親和力高于SARS-CoV S，說明其感染過程比SARS病毒更快。此外，我們使用ACE2功能化的SERS芯片檢測(cè)SARS-CoV-2時(shí)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)限LOD可以低到17.7 pM。而在無ACE2修飾的GNAs上滴加SARS-CoV-2 S時(shí)，LOD為0.63 nM。上述結(jié)果表明SARS-CoV-2S蛋白至少可以得到10*倍富集，遠(yuǎn)高于物理富集法的75倍富集。這可以歸因于液相中大多數(shù)S蛋白，由于被GNAs表面的ACE2受體捕獲而產(chǎn)生濃度梯度，并不斷富集在GNAs表面，而不是隨機(jī)布朗擴(kuò)散。結(jié)果表明，ACE2能夠選擇性地與表面表達(dá)S蛋白的病毒結(jié)合，并通過傾斜金納米針形成物理的“病毒捕集器”納米結(jié)構(gòu)，對(duì)準(zhǔn)確捕獲和富集SARS-CoV-2具有重要作用。

圖2. SARS-CoV-2 S、SARS-CoV S與ACE2的親和力分析。(a) SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白與ACE2功能化GNAs結(jié)合示意圖；(b, c) 不同濃度的SARS-CoV和 SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2功能化的GNAS結(jié)合隨時(shí)間變化的SERS光譜圖；(d) SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S蛋白與ACE2功能化的GNAs結(jié)合不同時(shí)間后檢測(cè)到的SERS信號(hào)強(qiáng)度；(e) 將ACE2功能化的和不含ACE2功能化的GNAs浸泡在稀釋后的蛋白溶液中檢測(cè)不同濃度的SARS-CoV-2 S的拉曼光譜強(qiáng)度。

IV?表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白和核殼蛋白的假病毒的SERS光譜分析，并建立鑒定標(biāo)準(zhǔn)

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩種表達(dá)SARS-CoV-2刺突蛋白和核殼蛋白的假病毒株，分別稱為VS和VN株。兩種病毒都有明顯的拉曼特征信號(hào)，如圖3所示。VS在568、644、884、950、1027、1310、1445 cm?1附近有明顯的拉曼光譜帶，這也是SARS-CoV-2 S蛋白的主要特征拉曼光譜帶。這說明病毒表面S蛋白占據(jù)了整個(gè)病毒顆粒的關(guān)鍵特征拉曼峰。此外，F(xiàn)DTD模擬的電磁增強(qiáng)位于距離納米針表面10納米的區(qū)域內(nèi)。得益于ACE2的高親和力和對(duì)SARS-CoV-2的特異性捕獲，SERS襯底將病毒的S蛋白局域在距離表面約10 nm的最強(qiáng)SERS區(qū)域內(nèi)，從而導(dǎo)致新冠S蛋白的高增強(qiáng)拉曼信號(hào)。因此，我們檢測(cè)了真正的SARS-CoV-2滅活病毒(圖3a-a)，其SERS光譜表現(xiàn)出與VS類似的Raman光譜特征。為了模擬SARS-CoV-2病毒污染水體的識(shí)別場(chǎng)景，分別在健康尿液中混合了兩種不同病毒(VS和VN)。通過ACE2-GNAs來檢測(cè)健康尿液中的兩種病毒，與未經(jīng)ACE2修飾的GNAs來檢測(cè)PBS溶液中的兩種病毒相比，拉曼光譜表現(xiàn)出了略微不同的拉曼峰。尿液中VS在884 cm?1附近具有明顯的特征拉曼峰，有別于尿液中的VN。然后，我們據(jù)此建立了一個(gè)新冠病毒的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分健康的尿樣和含有VS或VN病毒的尿樣。

圖3. 基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法建立并驗(yàn)證了SARS-CoV-2病毒識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)。(a) 健康的8歲女孩患者的PBS溶液和尿液中滅活的SARS-CoV-2，VN和VS的SERS光譜；(b) SARS-CoV-2 S位于EM增強(qiáng)區(qū)域10 nm處的示意圖；(c) 通過PCA對(duì)受VS，VN和健康人感染的尿液樣本進(jìn)行分類；(d) DA結(jié)果可識(shí)別出用于慢性腎炎和含VS的慢性腎炎的尿；(e) DA結(jié)果可識(shí)別成年人尿液中混合的VS和VN病毒(2200 拷貝/mL)；(f) 對(duì)于一個(gè)尿液樣本的300個(gè)測(cè)量區(qū)域的SERS mapping中，有42個(gè)點(diǎn)可以確定為VS陽性。

V?驗(yàn)證基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法的SARS-CoV-2識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)

接下來，我們驗(yàn)證了ACE2-GNAs作為SERS襯底對(duì)SARS-CoV-2的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)。為了模擬更復(fù)雜的多蛋白共存的污染水的檢測(cè)場(chǎng)景，基于該識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)了健康成人的尿液和含有病毒的慢性腎炎病人的尿液，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)100 個(gè)慢性腎炎病人尿液的SERS光譜可以歸因于VS-陰性(-)，而100個(gè)含VS的慢性腎炎病人尿液的SERS光譜可以正確地歸因于VS-陽性(+), 這說明ACE2功能化的SERS基片能夠準(zhǔn)確地從復(fù)雜的多蛋白環(huán)境中捕捉病毒和有效區(qū)分被病毒感染的尿液。為了證明ACE2功能化GNAs的選擇性捕獲冠狀病毒的能力，用DA方法對(duì)混合了VS和VN病毒的成人尿液進(jìn)行了鑒定分析，如圖3e所示。100份混合VS和VN病毒的樣本均為陽性，說明在多病毒共存的復(fù)雜環(huán)境下選擇性捕獲帶有SARS-CoV-2的VS病毒是有效的。

為了評(píng)估SERS芯片檢測(cè)病毒的檢測(cè)限，檢測(cè)了含VS的成人尿、含VS的慢性腎炎病人尿和低滴度的VS成人尿。我們發(fā)現(xiàn)含VS的成人尿液的6個(gè)SERS光譜，以及含VS的慢性腎炎尿液的6個(gè)SERS光譜均可歸因于VS陽性(+)，證明了VS在復(fù)雜的多蛋白共存的污染水環(huán)境中仍能被有效的捕獲。直到尿液樣本中的病毒載量降低到220 copies/mL，9個(gè)樣本中仍然有4個(gè)樣本被正確地歸為VS陽性(+)。就算尿液中的病毒載量下降到80 copies/mL，任然有42個(gè)點(diǎn)被確定為VS陽性(+)，如圖3f所示。同時(shí)，這也表明ACE2與S蛋白的高親和力和設(shè)計(jì)的“病毒陷阱”納米森林可以協(xié)同捕獲尿液樣本中約70%的VS。我們制備的ACE2功能化SERS芯片對(duì)VS病毒的檢測(cè)限低至80 copies/mL，可與RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度相媲美。?

作者簡介

楊勇

本文第一&通訊作者

上海硅酸鹽研究所 研究員

▍主要研究領(lǐng)域

(1)用于能源和環(huán)境的納米材料與納米傳感器件：貴金屬和半導(dǎo)體納米材料和結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和制備，納米材料的光學(xué)和催化特性研究；(2)光學(xué)薄膜及其應(yīng)用；(3)陶瓷增材制造科學(xué)。

▍主要研究成果

主要從事材料制備及其光學(xué)性能研究。主持研制了國內(nèi)第一套太空激光雷達(dá)用碳化硅光學(xué)部件，研發(fā)的陶瓷表面改性和光學(xué)鍍膜技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于北斗導(dǎo)航及實(shí)踐17號(hào)衛(wèi)星。迄今已在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物如Advanced Science, Nano Energy等刊物上發(fā)表SCI收錄論文100多篇，受邀為3本外文書籍(英文和日文)各撰寫一章。多次參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議作邀請(qǐng)報(bào)告，取得日本和中國多項(xiàng)授權(quán)專利。作為課題負(fù)責(zé)人承擔(dān)國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等重大項(xiàng)目，以及中科院“杰出人才計(jì)劃”和上海市浦江人才計(jì)劃等項(xiàng)目。

▍Email:?yangyong@mail.sic.ac.cn

本信息源自互聯(lián)網(wǎng)僅供學(xué)術(shù)交流 ，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系我們立即刪除。