2.2 蛋白表達

1)?將上述測序正確的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進BL21（DE3）感受態(tài)表達菌株中。并涂布到氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板中，于37℃培養(yǎng)12h。

2)?從上述平板中挑取單克隆菌落至5ml含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h；

3)?取上述菌液3ml至800ml含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6~0.8左右，加入0.5mM IPTG進行誘導表達，于18℃，220rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h;

4)?誘導結(jié)束，菌液以4000rpm條件離心30min，棄去上清液，用30mlTBS重懸菌體沉淀；

5)?將上述菌液于冰浴條件下進行菌體破碎，超聲功率為39%，超聲時間為25min;

6)?超聲破碎后以14000rpm離心30min，收集上清，隨后用0.45um濾膜過濾，并作為純化樣品液。

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2.3 蛋白純化

1.?超純水以3ml/min流速沖洗AKTA蛋白純化系統(tǒng)；

2.?將HisTrapTM柱安裝于AKTA純化系統(tǒng)上，用TBS進行柱平衡，直至紫外吸收值穩(wěn)定；

3.?將待純化樣品以上樣器上樣流速為1ml/min。上樣結(jié)束后，用TBS進行平衡；

4.?分別用4%、10%、30%、60%和100%的洗脫液進行蛋白梯度洗脫，對應的咪唑濃度依次為20mM、50mM、150mM、300mM和500mM。收集各洗脫峰對應的流出液；

5.?將收集到的流出液進行SDS-PAGE實驗，以鑒定目的蛋白的純度。

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2.4 蛋白透析及濃縮

1)?將純化后的蛋白溶液稀釋于TBS中至總體積為20ml，并裝入透析袋中，將透析袋置于1L的TBS中，于4℃條件下攪拌過夜；

2)?將過夜透析的蛋白溶液加至100 kDa超濾管中，于4℃，400rpm條件離心直至超濾管中沒有液體，向超濾管中加入1 ml TBS，緩慢吹打；

3)?將超濾管內(nèi)液體收集，應用BCA試劑盒進行打蛋白濃度的測定，蛋白于-80℃條件下凍存。

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2.5 脫鹽

1.?綜合分析各個重組蛋白的目的蛋白的表達量、目的蛋白的可溶性及目的蛋白的純化效果，最終選定效果較優(yōu)重組蛋白，通過脫鹽處理去除咪唑，乳糖對機體沒有傷害，可以不用去除，使用超濾管將目的蛋白進行濃縮，濃縮后的蛋白溶液使用BCA蛋白定量試劑盒測定重組蛋白的濃度。

2.?脫鹽處理步驟是將脫鹽柱提前平衡好，2.5ml蛋白樣品上柱，3.5ml洗脫置換到PBS中。蛋白濃縮是將脫鹽后的蛋白放入到超濾管中，4℃離心機，3000rpm/min離心5min多次離心直到里面的液體剩余2ml左右。取出100ul重組蛋白樣品用于電鏡檢測，觀察分析是否形成納米顆粒。

3.?透射電鏡觀察鐵蛋白納米籠形成情況，觀察和分析純化的融合蛋白是否形成納米顆粒。

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2.6 SDS-PAGE（雅酶試劑盒版本）

1)?取等體積的下層膠溶液和下層膠緩沖液，各2.0/2.7/4.0ml，混勻；

2)?向步驟1的混合溶液中加入40/60/80ul的改良型促凝劑，混勻；

3)?向步驟2的混合溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5cm即可（注意：此溶液為過量，請勿全部注入，可留少許于配膠板中，以判斷凝固狀況），加入適量水或醇（如異丙醇、正丁醇等）覆蓋于下層膠之上；

4)?待下層膠凝固后（約15min），倒去上層水或醇；

5)?取等體積上層溶液和彩色上層膠緩沖液，各0.5/0/75/1.0ml混勻；

6)?向步驟5的混合溶液中加入10/15/20ul的改良型促凝劑，混勻；

7)?向步驟6的混合溶液注入制膠玻璃板中，插入梳齒；

8)?待上層膠凝固后（約15min）。拔去梳齒即可用于電泳。

9)?將蛋白樣品以3:1體積比混合變性4xbuffer，混合均勻后于98℃加熱10min，離心后取上清進行電泳；

10)?電泳槽內(nèi)外加入Running Buffer，將蛋白樣品加入上樣孔，使用Bio-Rad蛋白電泳儀進行電泳，80V電壓條件下進行電泳20min，之后改為100V條件至電泳結(jié)束；

11)?凝膠電泳結(jié)束之后，使用凝膠染色液染色25min，隨后使用脫色液脫色45min。待脫色完全之后使用Tanon-5200發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖片記錄。

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2.7 重組蛋白Western blot鑒定

1.?將定量后的蛋白與等體積的2xSDS電泳上樣緩沖液混勻后99℃孵育變性10min，跑SDS-PAGE凝膠電泳，電泳120V跑至分離膠，換電壓160V跑，直至跑到膠底。

2.?電泳結(jié)束后小心將膠塊取下，切掉上層濃縮膠，將分離膠部分浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，同時安裝好電轉(zhuǎn)設備。

3.?取一塊和膠塊大小差不多的PVDF膜并放置在盛有甲醇的盒中浸泡5min，隨后將PVDF膜和海綿浸泡在轉(zhuǎn)模緩沖液中，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。

4.?按照海綿-PVDF膜-膠-海綿的順序放置并驅(qū)趕氣泡，“膜在正極，膠在負極”的順序放在盛有預冷的轉(zhuǎn)膜液的電泳槽內(nèi)，置于裝滿冰冰盒中，最后開通電源開關，調(diào)節(jié)電壓110V運行75min結(jié)束，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出電泳槽內(nèi)的PVDF膜放置在可盛有液體的盒子里，再放到搖床上用1xTBST緩沖液反復清洗3-5min，最后用5%脫脂奶粉（TBST緩沖液溶解）封閉，放置在水平搖床上室溫封閉1-2h。

5.?脫脂奶粉封閉結(jié)束后，用1xTBST緩沖液將PVDF膜反復清洗3次，每次5分鐘，再倒入1:1000稀釋的一級抗體，室溫孵育1h。

6.?一抗孵育結(jié)束后，棄掉一抗，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次5-10min。加入1:3000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。

7.?二抗孵育結(jié)束后，膜用TBST緩沖液體清洗3次，每次約為10min，在膜上滴加配制的底物顯色液與其反應，并用超靈敏多功能成像儀拍照分析。

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2.8 透射電鏡（TEM）及動態(tài)光散射（DLS）

通過TEM觀察納米顆粒的形態(tài)。簡要的說，將蛋白樣品滴加到銅網(wǎng)上，隨后用磷鎢酸進行染色，在100KV加速電壓下進行圖像觀察。使用納米粒徑檢測儀器檢測納米顆粒的尺寸。簡要的說，將蛋白樣品加入石英比色皿中，于90℃固定散射角進行粒徑檢測。