誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），是一種從成年（成熟）細(xì)胞生成的未成熟細(xì)胞，已經(jīng)恢復(fù)了分化為體內(nèi)任何類型細(xì)胞的能力。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）不同于胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），后者形成胚胎的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)，但也是多能的和原代細(xì)胞類似，最終導(dǎo)致構(gòu)成人體的所有細(xì)胞類型。誘導(dǎo)多能細(xì)胞最早是在2006年由日本醫(yī)師和研究員Shinya Yamanaka及其同事描述的。最初的實(shí)驗(yàn)是通過使用小鼠細(xì)胞進(jìn)行的。然而，第二年，Yamanaka成功地從人成年成纖維細(xì)胞中獲得了iPS細(xì)胞。在此之前，只能從早期人類胚胎中分離出人類干細(xì)胞。因此，iPS細(xì)胞的一個(gè)重要特征是它們的產(chǎn)生不需要胚胎，而胚胎的使用充滿了倫理問題。

使用CRISPR-Cas9對(duì)血友病患者自發(fā)iPSC中大因子VIII基因染色體倒置的功能校正

血友病A是由F8基因突變引起的X連鎖遺傳病，該基因編碼凝血因子VIII。在所有嚴(yán)重的血友病A病例中，幾乎有一半的病例是由兩個(gè)總的（140 kbp或600 kbp）染色體倒置導(dǎo)致的，分別涉及F8基因的內(nèi)含子1和22。研究人員從具有這些反轉(zhuǎn)基因型的患者中衍生出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），并使用CRISPR-Cas9核酸酶將這些染色體片段恢復(fù)為WT狀態(tài)。研究人員基于全基因組測(cè)序或靶向深度測(cè)序，分離了頻率高達(dá)6.7％的經(jīng)反向校正的iPSC，而沒有可檢測(cè)到的脫靶突變。在其他致命的血友病小鼠模型中，從校正的iPSC分化出來的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)F8基因并在功能上拯救了VIII因子缺乏癥。因此，結(jié)果為患者來源的iPSC中大染色體重排的功能校正提供了原理證明，并提出了潛在的治療應(yīng)用。

使用CRISPR-Cas9產(chǎn)生基因校正的自體iPSC來治療遺傳性視網(wǎng)膜變性

患者來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）對(duì)于自體細(xì)胞替代具有廣闊的前景。但是，對(duì)于許多遺傳性疾病，治療可能需要在移植前進(jìn)行基因修復(fù)?；蚓庉嫾夹g(shù)對(duì)該應(yīng)用程序很有用。這項(xiàng)研究的目的是開發(fā)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯策略，以靶向和糾正患者衍生的iPSC中三種最常見的致病變體類型：（1）外顯子，（2）深度內(nèi)含子（3)主導(dǎo)功能。研究人員開發(fā)了針對(duì)雄性生殖細(xì)胞相關(guān)激酶（MAK）外顯子9的純合Alu插入的同源性定向修復(fù)策略，并證明了患者細(xì)胞中視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的還原。研究人員產(chǎn)生了一種CRISPR-Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）方法，以切除導(dǎo)致Leber先天性黑病的主要因素，CEP290中的IVS26隱剪突變，并證明了患者iPSC中轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的校正。最后，研究人員設(shè)計(jì)了等位基因特異性CRISPR向?qū)?，可選擇性地靶向Pro23His視紫紅質(zhì)（RHO）突變體等位基因，在將其分別遞送至患者iPSC和體內(nèi)視網(wǎng)膜后，產(chǎn)生了移碼和過早的終止，可阻止該疾病的轉(zhuǎn)錄-導(dǎo)致變體。在這項(xiàng)研究中開發(fā)的策略將被證明對(duì)糾正導(dǎo)致的遺傳性視網(wǎng)膜變性基因中的多種遺傳變異有用。

CRISPR-Cas9靶向破壞HLA基因以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的免疫相容性的iPSC

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有巨大潛力。然而，由HLA失配引起的免疫排斥是一個(gè)問題。

B2M基因敲除和HLA純合iPSC群體可以解決此問題，但是前一種方法可能誘導(dǎo)NK細(xì)胞活性并且不能呈遞抗原，而為后一種方法招募稀少的體則是一個(gè)挑戰(zhàn)。研究人員展示了兩種用于制備免疫相容性供體iPSC的基因組編輯策略。首先，研究人員通過對(duì)HLA雜合iPSC進(jìn)行等位基因特異編輯，生成了HLA偽純合iPSC。其次，研究人員破壞了HLA-A和-B等位的基因，以抑制NK細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)保持抗原呈遞，從而創(chuàng)建了具有HLA-C保留能力的iPSC。

HLA-C保留的IPSC可以在體內(nèi)和體外逃逸T細(xì)胞和NK細(xì)胞。研究人員估計(jì)，結(jié)合HLA II類基因敲除的12種HLA-C保留的iPSC在免疫學(xué)上與世界90％以上的人口相容，極大地促進(jìn)了基于iPSC的再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。

Ubigene的目標(biāo)是簡(jiǎn)化基因組編輯。我們已經(jīng)開發(fā)了CRISPR-U?（基于CRISPR / Cas9技術(shù)），在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更高效。 CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率，并在體內(nèi)和體外輕松實(shí)現(xiàn)敲除（KO），點(diǎn)突變（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U?，Ubigene已成功編輯了100多個(gè)細(xì)胞系上的基因。

Reference

Park C Y, Kim D H, Son J S, et al. Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9[J]. Cell Stem Cell, 2015, 17(2): 213-220.

Burnight E R, Gupta M, Wiley L A, et al. Using CRISPR-Cas9 to Generate Gene-Corrected Autologous iPSCs for the Treatment of Inherited Retinal Degeneration[J]. Molecular Therapy, 2017, 25(9): 1999-2013.

Xu H, Wang B, Ono M, et al. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility[J]. Cell Stem Cell, 2019, 24(4).

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明。

關(guān) 注 供 縱 昊 “源井生物”，了解更多基因編輯相關(guān)資訊。