01排阻色譜法純度測定

排阻色譜法（Size Exclusion Chromatography，SEC）又稱尺寸排阻色譜法、分子排阻色譜法、凝膠排阻色譜法、空間排阻色譜法，是液相色譜的一種主要分離模式。主要用于分離大分子，從而實(shí)現(xiàn)高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試，還可分離油溶性和水溶性物質(zhì)。目前，SEC技術(shù)正被越來越多的應(yīng)用于天然聚合物、合成聚合物和蛋白質(zhì)的分離與表征，生物藥的純度是生產(chǎn)質(zhì)控的重要指標(biāo)之一。

儀器構(gòu)造

HPLC-SEC系統(tǒng)主要由溶劑輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。操作簡便快捷、數(shù)據(jù)可靠且重現(xiàn)性好，自動化程度高。

排阻色譜的色譜柱填料是凝膠，凝膠表面有不同尺寸的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被滯留，大分子物質(zhì)通過時被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒間迅速通過，從而實(shí)現(xiàn)分子篩效應(yīng)，將混合物按照分子量大小分開。分子量越小離開色譜柱的時間越長，依據(jù)色譜峰是否單一來判斷樣本的純度。

結(jié)果展示

色譜圖-數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)將檢測器響應(yīng)為色譜圖中保留時間的函數(shù)，對色譜圖下的峰進(jìn)行積分確定峰面積，該峰面積與樣本中組分存在濃度成正比。使用高效液相進(jìn)行純度分析。依據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析；根據(jù)色譜峰的峰面積或者峰高進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的單一性來判斷樣本的純度。

送樣標(biāo)準(zhǔn)

蛋白質(zhì)樣品可以是干粉、溶液；蛋白純度>95%；蛋白質(zhì)量>500 μg，濃度0.5μg/μL以上；

02SDS-PAGE

SDS-PAGE-十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，是最常用的蛋白表達(dá)分析技術(shù)，是對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化、比較以及特性鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速、可重復(fù)的方法可以用于鑒定蛋白的表達(dá)情況（表達(dá)量和表達(dá)分布）以及分析目的蛋白的純度等。

技術(shù)原理

SDS-PAGE主要利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)，測定分子量的大小。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。

在凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉)，有變性劑與助溶劑的作用，和蛋白的疏水部分結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，從而讓多肽變性，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電，削弱了蛋白質(zhì)電泳時電荷和分子量大小的因素。當(dāng)分子在15-200KD時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)稱線性關(guān)系。分子量越小，遷移速率越快。

應(yīng)用范圍

蛋白質(zhì)純度分析、分子量測定、濃度測定、免疫沉淀蛋白鑒定、蛋白質(zhì)修飾鑒定、分離和濃縮用產(chǎn)生抗體的抗原、分離放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

結(jié)果展示

送樣標(biāo)準(zhǔn)

蛋白質(zhì)樣品可以是干粉、溶液；蛋白純度>95%；蛋白質(zhì)量>20 μg，濃度0.5μg/μL以上；

03CE-SDS

CE-SDS(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate)十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管凝膠電泳，因快速高效、靈敏度高，在生物大分子純度分析方面取代了平板凝膠電泳，相比傳統(tǒng)的電泳實(shí)驗(yàn)，自動的紫外-可見光檢測器針對物質(zhì)吸收進(jìn)行信號檢出與定量，避免了分離介質(zhì)品質(zhì)不均一、染料定量判定不嚴(yán)格的缺點(diǎn)，提供了更優(yōu)的精密度與分離度。目前，毛細(xì)管電泳在生命科學(xué)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，主要用于生物技術(shù)藥物的純度分析、等電點(diǎn)以及電荷異質(zhì)性分析、糖基分析。

原理

毛細(xì)管內(nèi)充滿凝膠，凝膠會在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩。毛細(xì)管兩端通高電壓，以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，使凝膠內(nèi)帶電分子移動到毛細(xì)管相反電荷的一端，因?yàn)椴煌肿拥拇笮∫约半姾杀炔煌?，以不同的速率在管中移動，依此探測、分離樣本。

v=uE

（v:電場遷移速率；u：電流淌度；E電場強(qiáng)度=V/L,V=電壓，L=毛細(xì)管總長度）

結(jié)果展示

CE-SDS方法基于蛋白分子量的差異分離，用于還原和非還原單抗藥物的純度分析，免去了復(fù)雜的人工操作、定量更加準(zhǔn)確，具有更高的分辨率，在還原模式中可對非糖基化重鏈進(jìn)行分離和準(zhǔn)確定量。

CE-SDS對還原單克隆抗體藥物的純度分析

CE-SDS的優(yōu)勢

1、所需樣本量少、儀器簡單、操作簡便。

2、分析速度快、分離效率高、分辨率高、靈敏度高。

3、無需制膠，省時省力，也無需照膠，避免人工誤差。

4、安全、廢液少比較環(huán)保。

送樣標(biāo)準(zhǔn)

蛋白質(zhì)樣品可以是干粉、溶液；蛋白純度>95%；蛋白質(zhì)量>50 μg，濃度0.5μg/μL以上。