基于m7G相關LncRNA構建乳腺癌預后特征及免疫分析
結(jié)果
差異基因的獲得
我們從 TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得了 1,113 個乳腺癌組織和 113 個正常組織的 RNA-seq 數(shù)據(jù)。使用 Wilcoxon 檢驗比較乳腺癌和非腫瘤組織之間的 DEGs (|log2FC|>1, FDR<0.05)。發(fā)現(xiàn)了17個與m7G相關的基因，包括7個下調(diào)基因和10個上調(diào)基因（圖 1A–C).
構建 BC 中 m7G 相關 lncRNA 的預測特征
我們總共獲得了 1,090 個與 m7G 相關的 lncRNA。根據(jù)單變量 Cox 回歸分析（補充圖 S1），43 個 LncRNA 與 BC 患者的預后有關。與 m7G 相關的九個 lncRNA（LINC01871、AP003469.4、Z68871.1、AC245297.3、EGOT、TFAP2A-AS1、AL136531.1、SEMA3B-AS1、AL606834.2）可用作 BC 患者的預測特征，根據(jù)多元Cox回歸和Lasso回歸分析（圖 2A–C).?其中，（LINC01871、AC245297.3、EGOT、TFAP2A-AS1、AL136531.1、SEMA3B-AS1、AL606834.2）為保護因子，（AP003469.4、Z68871.1）為危險因子。此外，九個m7G相關的lncRNA和臨床病理因素在高風險和低風險人群中的分布也顯示在熱圖上（圖 2D).?結(jié)果顯示，兩組間在性別（p?<0.001）、臨床分期（p?<0.05）、T分期（p?<0.05）、M分期（p?<0.05）、N分期（p?<0.05）上存在差異, 但沒有出現(xiàn)任何顯著的年齡差異。然后，為了顯示 LncRNA 和 mRNA 之間的聯(lián)系，我們使用 Cytoscape 創(chuàng)建了 lncRNA 和 mRNA 的網(wǎng)絡圖（圖 3A), 同時, 我們制作了?；鶊D (圖 3B).?然后根據(jù)多變量 Cox 回歸分析確定的相關系數(shù)確定每位 BC 患者的風險評分，并根據(jù)中位風險評分將患者分為低風險組和高風險組。我們用來確定風險評分的公式如下： RiskScore=(?0.549×LINC01871 expression) + (0.553×AP003469.4 expression) + (0.746×Z68871.1 expression) + (?0.449×AC245297.3 expression) +（-0.458×EGOT 表達）+（-0.665×TFAP2A-AS1 表達）+（-0.642×AL136531.1 表達）+（-0.270×SEMA3B-AS1 表達）+（-0.806×AL606834.2 表達）。
BC 壞死相關 lncRNA 特征的建立。(A)使用十倍交叉驗證，確定最佳轉(zhuǎn)向參數(shù) (logλ)。(B)最小絕對收縮和選擇運算符 (LASSO) 算法對變量選擇的 10 倍交叉驗證。(C) BC 和正常組織中九種 m7G 相關 lncRNA 的表達水平。(D)高風險和低風險人群中的九種預后 m7G 相關 lncRNA 和臨床病理因素分布熱圖?？s寫：BC，乳腺癌；m7G，N7-甲基鳥苷；lncRNA，長鏈非編碼RNA；N，淋巴結(jié)；M，轉(zhuǎn)移；T，腫瘤。
與N7-甲基鳥苷基因相關的LncRNAs和mRNAs之間的關系。(A)預后 m7G 相關 lncRNA 的共表達網(wǎng)絡。(B)預后性 m7G 相關 lncRNA 的 Sankey 圖。縮寫：lncRNAs，長鏈非編碼RNA；m7G，N7-甲基鳥苷；BC，乳腺癌。
N7-甲基鳥苷相關的 LncRNA 特征與 BC 患者的預后：相關性
首先，為了建立 m7G 相關 lncRNA 譜與 BC 患者預后之間的聯(lián)系，我們進行了 Kaplan-Meier 分析以評估高風險和低風險 BC 組之間的生存期。如圖（圖 4A), 高風險組的 OS 時間明顯短于低風險組。熱力圖、散點圖、風險曲線都是同時繪制的（圖 4B–D)，并且可以看出，隨著時間的推移，風險評分越高，BC患者死亡人數(shù)越多，預后越差。之后，我們進行了多變量 ROC 分析以及單變量和多變量 Cox 回歸分析，以查看預測特征是否是 BC 患者預后的可靠預測因子。年齡、TNM 分期、臨床分期和風險評分 (?p?< 0.05) 與 BC 患者的 OS 顯著相關，如單變量 Cox 回歸分析圖所示 (圖 5A).?在 BC 患者中，多變量 Cox 回歸分析顯示年齡和風險評分 (?p?< 0.05) 是 OS 的獨立預測因子 (圖 5B).?用于預測 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲線下面積 (AUC) 值分別為 0.715、0.724 和 0.726（圖 5C)，這證明了該特征在預測乳腺癌預后方面的有效性。風險評分的AUC值為0.777，在預測BC患者預后方面高于臨床變量（圖 5D).?通過RiskScore、Kaplan-Meier分析曲線、風險分布、生存結(jié)果、壞死相關lncRNAs在訓練集和測試集的表達情況，使用單一公式進行分析（圖 6A–J)，結(jié)果證明了我們的預測模型的準確性。此外，將風險評分模型和臨床變量相結(jié)合以創(chuàng)建精確的預后列線圖（圖 7A).?校準曲線表明 1、3 和 5 年的實際和預期生存率具有良好的一致性（圖 7B–D).
CC患者預后與預測特征的關系。(A) Kaplan-Meier 分析比較了高風險和低風險 BC 患者的 OS。(B) BC 患者的風險評分分布。(C)死亡和存活的具有各種風險評分的患者數(shù)量。橙色表示有多少人死亡，紫色表示有多少人幸存。(D)與 m7G 相關的九個 lncRNA 的表達熱圖?？s寫：m7G，N7-甲基鳥苷；lncRNA，長鏈非編碼RNA；BC，乳腺癌；OS，總生存期。
壞死性凋亡相關 lncRNA 預后特征的評估。(A)對臨床特征和風險評分進行單變量 Cox 回歸分析。(B)風險評分和臨床特征進行多變量 Cox 回歸分析。(C)用于預測 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲線。(D)風險評分和臨床病理因素的 ROC 曲線?？s寫：m7G，N7-甲基鳥苷；lncRNA，長鏈非編碼RNA；BC，乳腺癌；ROC，接受者操作特征；AUC，曲線下面積；T，腫瘤；N，淋巴結(jié)；OS，總生存期。
訓練、測試中 9 個 m7G 相關 lncRNA 特征的預后值。風險曲線（A，B），生存散點圖（C，D），9個lncRNA表達熱圖（E，F(xiàn)），BC患者ROC曲線（G，H），Kaplan-Meier生存曲線（I，J )分別在train、test中的低風險和高風險人群之間。縮寫：m7G，N7-甲基鳥苷；lncRNA，長鏈非編碼RNA；BC，乳腺癌；ROC，接受者操作特征；AUC，曲線下面積。
列線圖的構建。(A)整合臨床病理因素和風險評分的列線圖預測 BC 患者 1、3 和 5 年的 OS。(B – D)校準曲線檢查預測的 1、3 和 5 年生存率是否與當時的實際 OS 率一致。縮寫：OS，總生存期；BC，乳腺癌。
BC 患者預后與各種臨床協(xié)變量和預測特征的關系
根據(jù)臨床病理因素將乳腺癌患者分成許多組，以檢查各種臨床協(xié)變量對 BC 患者預后的影響（圖 8A–L).?對于每個分類，高風險組中 BC 患者的 OS 明顯低于低風險組。這些結(jié)果進一步證明了預測簽名的準確性。
不同臨床病理變量下的風險曲線。（一）年齡。(B)性別。(C , D) T 階段。(E – G) N 階段。(H , I) M 階段。(J – L)階段?？s寫：T，腫瘤；N，淋巴結(jié)；M，轉(zhuǎn)移。
功能分析
然后我們進行了 KEGG 和 GO 功能富集分析。在 KEGG 分析中（圖 9A), m7G 相關的 lncRNA 主要聚集在細胞周期、原發(fā)性免疫缺陷、Erbb 信號通路、間隙連接、RNA 降解和卵母細胞減數(shù)分裂中。在GO分析中（圖 9B)，m7G相關的lncRNAs主要集中在ATP水解活性、T細胞穩(wěn)態(tài)、紡錘體定位、淋巴細胞介導免疫調(diào)節(jié)、適應性免疫反應調(diào)節(jié)和淋巴細胞穩(wěn)態(tài)。
KEGG 和 GO 富集分析。(A) KEGG 富集分析。(B) GO 富集分析?？s寫：GO，基因本體論；KEGG，京都基因和基因組百科全書。
免疫系統(tǒng)成分及活性分析
我們研究了風險模型與免疫相關成分之間的關系，因為研究人員最近發(fā)現(xiàn)免疫因素在癌癥中起著重要作用。我們使用ssGESA分析了免疫細胞和免疫通路，結(jié)果顯示（圖 10A) aDCs、B 細胞、CD8?+?T 細胞、NK 細胞、T 輔助細胞和 Th1 細胞在低風險 BC 組中表達更多。在 APC 共刺激、檢查點、HLA、炎癥促進、T 細胞共抑制和 I 型干擾素反應方面，低風險組的免疫功能評分高于高風險組（圖 10B)，這表明低風險乳腺癌患者比高風險患者具有更活躍的免疫系統(tǒng)。然后我們分析了免疫檢查點（圖 10C、D)，我們從圖中可以看出，幾乎每一個免疫檢查點都被揭示在低危BC組中更加活躍，包括CD274(PDL1)、LAG3、PDCD1(PD1)、TNFRSF18和LGALS9，提示這些個體可能是對免疫療法更敏感。
風險評分和免疫相關因素分析。(A)免疫細胞的相關性分析。(B)免疫相關通路分析。(C) CD274 (PD-L1) 在高危和低危人群中的表達。(D)風險人群中常見免疫檢查點表達的差異?？s寫：ssGSEA，單樣本基因集富集分析；PD-L1，程序性細胞死亡配體 1；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；ns，不顯著。
藥敏分析
由于低風險 BC 患者對免疫療法更敏感，我們對比了高風險和低風險組之間的藥物敏感性（圖 11A–F)，研究結(jié)果顯示，低危BC患者對免疫藥物AZD7762、CCT018159、CGP.60474和化療藥物依托泊苷、吉西他濱反應較好，但對靶向藥物伊馬替尼耐藥。這些結(jié)果證明，研究適合高風險和低風險 BC 組的專門治療計劃是有益的。
藥物敏感性分析。(A) AZD7762 在高風險和低風險人群中的 IC50。(B) CCT018159 在高風險和低風險人群中的 IC50。(C) CGP.60474 在高風險和低風險人群中的 IC50。(D)依托泊苷在高危和低危人群中的 IC50。(E)吉西他濱在高危和低危人群中的 IC50。(F)伊馬替尼在高危和低危人群中的 IC50。縮寫：IC50，半數(shù)最大抑制濃度。
?主成分分析進一步證明m7G相關lncRNA特征的可靠性
使用主成分分析 (PCA) 證實，高風險和低風險 BC 組之間存在差異。這個圖片顯示著 （圖 12A–D)，預后風險模型可以區(qū)分高風險和低風險 BC 組，這進一步說明了簽名的準確性。
主成分分析 (PCA)。(A)整個基因表達譜。(B)與 m7G 相關的基因。(C)連接到 m7G 的 LncRNA。(D)基于與 m7G 相關的 lncRNA 的預測特征?？s寫：m7G，N7-甲基鳥苷。lncRNA; 長鏈非編碼 RNA。
預測模型與臨床變量的相關性分析
我們使用 TCGA 數(shù)據(jù)庫中的基因表達數(shù)據(jù)和相關臨床數(shù)據(jù)檢查了這些臨床特征與預測特征之間的關系（圖 13A–H): LncRNA AL606834.2與T期相關；lncRNA EGOT與臨床分期和T期相關；lncRNA SEMA3B-AS1與年齡、M期、N期相關；LncRNA TFAP2A-AS1與臨床分期和M期相關。
與 m7G 相關的九個 lncRNA 與臨床特征之間的聯(lián)系。(A) lncRNA AL606834.2 表達與 T 期的關聯(lián)。 (B – D) lncRNA SEMA3B-AS1 表達水平與年齡、M 期、N 期的關聯(lián)。 (E , F) lncRNA EGOT 表達水平與臨床分期的關聯(lián)，T期。（G，H） lncRNA TFAP2A-AS1表達水平與臨床分期的關聯(lián)，M期。縮寫：m7G，N7-甲基鳥苷；lncRNA，長鏈非編碼RNA；N，淋巴結(jié)；M，轉(zhuǎn)移；T，腫瘤。
?BC中m7G相關lncRNA表達的外部驗證
通過 qRT-PCR，我們檢測了 9 個 m7G 相關 lncRNA 在 BC 組織和正常組織中的相對表達水平。結(jié)果表明，AP003469.2 和 Z68871.1 在 BC 組織中顯著增加，而 LINC01871、AC245297.3、EGOT、TFAP2A-AS1、AL136531.1、SEMA3B-AS1 和 AL606834.2 顯著減少（圖 14).?這些結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果一致。
使用 qRT-PCR 分析鑒定與乳腺癌中 m7G 相關的血漿 lncRNA。血漿AP003469.4 (A)、Z68871.1 (B)、TFAP2A-AS1 (C)、EGOT (D)、AC245297.3 (E)、SEMA3B-AS1 (F)、AL136531.1 ( G)、AL606834.2 (H)、LINC01871 (I)通過 qRT-PCR 在乳腺癌組織和正常組織中測量。* p < 0.05.** p < 0.01。
