一、百螢Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒概述

?Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒?紅色熒光是AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測(cè)半胱天冬酶活性的試劑盒。半胱天冬酶在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。 Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的對(duì)于細(xì)胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鑒定為篩選靶標(biāo)。半胱天冬酶抑制劑具有和其他藥理學(xué)潛力。已經(jīng)證明caspase 3/7對(duì)肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物選擇性。我們的Amplite?熒光Caspase 3/7檢測(cè)試劑盒使用Z-DEVD-ProRed?作為caspase的熒光指示劑-3活動(dòng)。通過(guò)Caspase 3/7切割ProRed DEVD阻斷肽殘基產(chǎn)生強(qiáng)烈紅色熒光ProRed，其在~620nm下熒光測(cè)量，激發(fā)~535nm。Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒?紅色熒光可用于測(cè)量細(xì)胞提取物和純化酶中caspase 3/7的活性，以及篩選caspase 3/7抑制劑。該試劑盒以96孔格式每孔使用100μl試劑，提供足夠的試劑進(jìn)行100次分析。該試劑盒以384孔的形式每孔使用25ul試劑，提供足夠的試劑進(jìn)行400次分析。

二、百螢Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方案

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概述

用測(cè)試化合物（100μL/ 96孔板或25μL/ 384孔板）

制備細(xì)胞體積的半胱天冬酶3/7測(cè)定溶液

在室溫下孵育1小時(shí)

在Ex / Em = 535 / 620nm處監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度

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操作方法

1.準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.1對(duì)于粘附細(xì)胞：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將細(xì)胞在20,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 90L下過(guò)夜，96孔板或5,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對(duì)于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細(xì)胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細(xì)胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。 在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的佳細(xì)胞密度。

2.準(zhǔn)備庫(kù)存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D和E）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲(chǔ)備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Ac-DEVD-CHO小瓶（組分D）中。 該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號(hào)強(qiáng)度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。

注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲(chǔ)備液等分并在-20°C下干燥儲(chǔ)存。

3.準(zhǔn)備Caspase 3/7檢測(cè)溶液：

將50μL200X胱天蛋白酶3/7底物儲(chǔ)備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X caspase 3/7底物儲(chǔ)備液足以進(jìn)行100次測(cè)定，每次測(cè)定的反應(yīng)體積為100μL。 未使用的200X caspase 3/7底物儲(chǔ)備液應(yīng)等分，在-20°C干燥儲(chǔ)存，避光。

4.運(yùn)行Caspase 3/7測(cè)定：

4.1通過(guò)將10μL10X測(cè)試化合物（96孔板）或5μL5X測(cè)試化合物（384-板）加入PBS或所需緩沖液中來(lái)處理細(xì)胞。 對(duì)于空白孔（沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。

4.2將細(xì)胞板在培養(yǎng)箱中孵育一段所需的時(shí)間（用喜樹(shù)堿處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶3/7測(cè)定溶液（來(lái)自步驟3）。

4.4將板在室溫下孵育至少1小時(shí)，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測(cè)定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟2.2）加入選定的樣品中，以確認(rèn)Caspase 3 / 7個(gè)類(lèi)似的活動(dòng)。

注2：如果需要，通過(guò)將5mM R110標(biāo)準(zhǔn)品（組分E）稀釋到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中制備R110標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到系列稀釋的R110標(biāo)準(zhǔn)品，范圍為0-50M。將100μL連續(xù)稀釋的R110標(biāo)準(zhǔn)品加入含有的孔中。 在測(cè)量熒光之前的任何時(shí)間，100μLCaspase3/7測(cè)定溶液。 該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定含有胱天蛋白酶3/7的反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物的摩爾數(shù)。

4.5在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非粘附細(xì)胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 490 / 525nm處觀察熒光增加。

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數(shù)據(jù)分析

? ? ? ? 從具有細(xì)胞的那些孔值中減去具有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的空白孔中的熒光?？瞻卓椎谋尘盁晒飧鶕?jù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基或微量滴定板的來(lái)源而變化。