? ? ? ?大家好， 今天和大家分享一篇發(fā)表于 JACS 上的工作， 題目為“Resistive-PulseSensing Inside Single Living Cells”。本篇文章的通訊作者是美國紐約城市大學(xué)皇后學(xué)院化學(xué)與生物化學(xué)系 Michael V. Mirkin 教授和南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院的江德臣教授。Resistive-Pulse 傳感技術(shù)主要基于顆粒經(jīng)過納米孔或納米通道產(chǎn)生阻塞電流的原理，常被用于檢測納米尺寸的單個顆?；騿蝹€細(xì)胞囊泡。但由于Resistive-Pulse 檢測的靈敏度很高，因此很容易受到基質(zhì)中各種物質(zhì)的干擾， 現(xiàn)有的 Resistive-Pulse 傳感技術(shù)對單個顆?；騿蝹€細(xì)胞囊泡等的檢測都是以成分較為簡單的大體積溶液體系為分析對象， 并且需要確保溶液相體系中幾乎沒有雜質(zhì)或表面活性劑。將其應(yīng)用于復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境的直接檢測是十分困難的。
? ? ? ?本工作中，作者將 Resistive-Pulse 傳感中用到的納米管同時作為掃描離子電導(dǎo)顯微鏡（ scanning ion conductance microscopy， SICM）探針， 結(jié)合 Resistive-Pulse傳感與 SICM 發(fā)展了能夠在單個細(xì)胞內(nèi)或單個細(xì)胞周圍檢測細(xì)胞囊泡或顆粒的Resistive-Pulse 傳感技術(shù)（圖 1）：探究了探針插入細(xì)胞膜過程中的離子電流變化；實現(xiàn)了巨噬細(xì)胞（ RAW 264.7） 中囊泡（吞噬體、溶酶體、吞噬溶酶體）、細(xì)胞內(nèi)吞的金納米粒子、胞囊泡中活性氧和氮（ ROS/RNS） 的檢測；還實現(xiàn)了乳腺癌細(xì)胞（ MDA-MB-231）釋放細(xì)胞外囊泡過程的觀測。

? ? ? 作者制備了一系列不同材質(zhì)、 不同尺寸的納米管，包括普通的石英管，導(dǎo)電碳鍍層管（ conductive carbon nanopipettes， CNP），鉑鍍層 CNP，尺寸為 25 nm 到400 nm。首先利用 150 nm 的石英管探究 SICM 探針插入細(xì)胞膜的過程。向溶液相的 Ag/AgCl 電極及管內(nèi)的 Ag/AgCl 電極間施加 0.4 V 的電壓， 使探針逐漸接近固定的 RAW 264.7 細(xì)胞，在電流變化上觀察到探針靠近細(xì)胞、穿破細(xì)胞膜、進(jìn)入細(xì)胞三個過程（圖 2）。其中，1過程探針與細(xì)胞膜距離較遠(yuǎn)，電流與距離無關(guān)；2 過程表示探針作用于細(xì)胞膜并刺穿，電流快速下降；3 過程表示探針進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時能夠固定探針位置檢測 Resistive-Pulse 信號。該電流距離特征曲線在后續(xù)的細(xì)胞分析中能夠用于明確探針在細(xì)胞中或細(xì)胞周圍的定位。

? ? ? 隨后，作者檢測了 RAW 264.7 細(xì)胞中大量存在的囊泡（吞噬體、溶酶體、吞噬溶酶體）等。利用出口尺寸 140 nm 的石英管，檢測到 Resistive-Pulse 信號的位移時間為 3-10 ms 且振幅分布非常廣，?1%到100%電流封閉，表面所檢測的囊泡尺寸為 40-140 nm。當(dāng)更換更小尺寸的探針（32 nm）時?未檢測到 ResistivePulse 信號，表明吞噬體、溶酶體、吞噬溶酶體等囊泡尺寸均大于 30 nm。常見溶液相體系中的 Resistive-Pulse 信號是不對稱峰，電流先快速降低再緩慢恢復(fù)，而細(xì)胞內(nèi)測得信號電流下降緩慢且位移時間更長，這與細(xì)胞內(nèi)的高粘度復(fù)雜環(huán)境有關(guān)。作者還檢測了 RAW 264.7 細(xì)胞內(nèi)吞的 10 nm 金納米粒子。由于在之前的實驗測試中表面，細(xì)胞中不存在 10-30 nm 的顆粒信號，因此，作者向細(xì)胞中引入10 nm 的納米金，并用 30 nm 尺寸的探針檢測，用于方法驗證，還能用于研究納米粒子在細(xì)胞內(nèi)的聚集過程。其信號檢測及位移時間分析結(jié)果均與之前的囊泡測試體系相同。且細(xì)胞內(nèi)納米金的 Resistive-Pulse 信號出現(xiàn)頻率隨納米金與細(xì)胞孵育時間增長而提高。
? ? ? ?以 CNP 作為工作電極在實現(xiàn) Resistive-Pulse 的同時還能夠測試碳層表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)。因此，作者還利用 CNP 探針或鉑鍍層 CNP 進(jìn)一步檢測了囊泡中的活性氧和氮（ROS/RNS）。在 210 nm 鉑鍍層 CNP 測試中（圖 3）， 在由于囊泡阻塞探針而出現(xiàn)的電流降低的 Resistive-Pulse 信號外，還出現(xiàn)了明顯的由于囊泡與碳電極表面碰撞，其中 ROS/RNS 氧化而產(chǎn)生的電流上升的信號， 由于探針限制了僅能測試到來源于單一囊泡中的 ROS/RNS 信號。在 CNP 電勢為 0.8 V時， 能夠檢測到四種巨噬細(xì)胞內(nèi)主要的 ROS/RNS（H2O2， ONOO-， NO?和 NO2–）。通過不斷提高電勢分別實現(xiàn)四種 ROS/RNS 的依次檢測：300 mV （H2O2）， 450mV （H2O2， ONOO-）， 620 nm （H2O2， ONOO-， NO?）， 800 mV 四種 ROS/RNS。通過檢測到的電流估算單個囊泡中的四種 ROS/RNS 含量約為 pmol 量級：1.1x10-8 (H2O2)， 1x10-9 (ONOO-)， 6.7x10-8 (NO?)， 1.1x10-7 (NO2-)。

? ? ? 作者還將 300 nm 的石英探針位置固定在細(xì)胞外，靠近細(xì)胞的位置，用于檢測 MDA-MB-231 細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的囊泡（圖 4）。囊泡在亞微米級別細(xì)胞及納米尺寸下的擴(kuò)散時間基本處于毫秒級，因此，該技術(shù)能夠用于囊泡的實時檢測。該技術(shù)檢測獲得的細(xì)胞釋放囊泡頻率約為 0.4 s-1，該頻率確實遠(yuǎn)小于細(xì)胞內(nèi)檢測到囊泡的頻率。

? ? ? 綜上所示， 作者搭建了局域的 Resistive-Pulse 傳感平臺，成功將其應(yīng)用于單細(xì)胞內(nèi)及單細(xì)胞周圍n?尺寸囊泡/納米顆粒的實時檢測，并同時能夠獲得單一囊泡中 ROS/RNS 含量信息。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.9b13796