圍繞一個(gè)單基因，到底還能玩出什么花？

小云和大家分享過多個(gè)單基因的思路，如對(duì)單基因分析感興趣的話，可以看一下我們前期三篇文章：

“單基因分析可做哪些內(nèi)容？以8+文章為例，將10個(gè)研究步驟全部匯總，免疫浸潤(rùn)、單細(xì)胞等熱點(diǎn)一網(wǎng)打盡，快來抄作業(yè)！”

“干貨來襲！生信底牌— —單基因生信分析思路模板，墻裂推薦，生信小白閉眼入?。?！”

“怎么找單基因分析的“Mr Right”？最新Science文章來做紅娘！這個(gè)基因關(guān)聯(lián)腫瘤微環(huán)境和免疫治療，輕松發(fā)到8分+！”

看了前面各種單基因分析的盤點(diǎn)后，今天小云再推薦一個(gè)分析方式---利用多組學(xué)，從多維度來論述同一個(gè)基因，講究的是“螺螄殼里做道場(chǎng)”，麻雀雖小五臟俱全。

比如，圍繞著一個(gè)基因，從轉(zhuǎn)錄、蛋白、突變、表觀和單細(xì)胞組等層面開展論述，將分析做到極致，玩出花來。

接下來，小云就以這篇8+的研究TTK基因與子宮內(nèi)膜癌的干濕結(jié)合文章為案例，進(jìn)行分析展示，方便大家復(fù)現(xiàn)。

l?題目：綜合多組學(xué)分析和功能驗(yàn)證表明TTK是一種新型的子宮內(nèi)膜癌 EMT 激活劑

l?雜志：Journal of Translational Medicine

l?影響因子：IF=8.4

l?發(fā)表時(shí)間：2023年2月

研究背景

癌-睪丸抗原(CTA)通常在腫瘤和睪丸組織中表達(dá)，在其他正常組織中不表達(dá)。然而，目前沒有全面研究與子宮內(nèi)膜癌(EC)發(fā)展相關(guān)的CTA基因的表達(dá)和臨床意義，并且EC中CTA基因TTK蛋白激酶(TTK)的臨床相關(guān)性、生物學(xué)作用和分子機(jī)制也尚未完全了解。本文目的在于探索TTK基因在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)作用以及機(jī)制探索。

公共數(shù)據(jù)來源

研究思路

對(duì)EC的TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)和GEO芯片數(shù)據(jù)為對(duì)象，采用Limma包篩選出差異基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行WGCNA分析構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；通過使用特定基因模塊的中值表達(dá)，將來自TCGA的EC樣本分為兩組：高表達(dá)和低表達(dá)組，利用KM生存曲線比較兩個(gè)組別之間的生存差異，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與預(yù)后相關(guān)的表達(dá)差異顯著的癌-睪丸抗原(CTA)基因；使用ROC分析來驗(yàn)證CTA基因中的TTK蛋白激酶(TTK)的臨床診斷價(jià)值；進(jìn)一步評(píng)估TTK基因的蛋白表達(dá)、基因突變、拷貝數(shù)變異和甲基化修飾差異等信息；在單細(xì)胞水平分析TTK基因的細(xì)胞定位；最后在細(xì)胞系中進(jìn)行TTK基因的驗(yàn)證和功能試驗(yàn)。

主要結(jié)果

1. 針對(duì)EC患者表達(dá)譜數(shù)據(jù)的CTA相關(guān)基因篩選

將從CTDatabase檢索到的255個(gè)CTA相關(guān)基因，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)80個(gè)CTA基因上調(diào)，17個(gè)基因下調(diào)（圖1A）。對(duì)80個(gè)上調(diào)的CTA基因進(jìn)行ssGSEA分析，并根據(jù)富集分?jǐn)?shù)將EC樣本分成高CTA評(píng)分（CTA高）組和低CTA評(píng)分（CTA低）組（圖1B）。差異基因分析顯示，80個(gè)CTA基因中有45個(gè)在CTA高組中顯著高表達(dá)（圖1D）。對(duì)45個(gè)上調(diào)基因進(jìn)行了單變量cox回歸，發(fā)現(xiàn)其中三個(gè)（TTK、LY6K和NOL4）導(dǎo)致了不良結(jié)果（圖1F）。經(jīng)GSE17025數(shù)據(jù)集驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TTK在I期EC組織中顯著更高（圖1G）。生存分析表明，高TTK表達(dá)與EC患者較短的總生存期顯著相關(guān)（圖1H）。TTK表達(dá)還可用于區(qū)分早期EC組織與正常組織，對(duì)早期EC診斷的AUC為0.873（圖1I）。以上數(shù)據(jù)顯示TTK在EC中上調(diào)，可能成為EC診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。（ps：火山圖也可以用小云新開發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺(tái)包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。

2. TTK表達(dá)水平升高與EC表型相關(guān)

利用TIMER1.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TTK的表達(dá)水平進(jìn)行泛癌分析。與正常樣本相比，TCGA中幾乎所有腫瘤類型中TTK的mRNA表達(dá)顯著更高（圖2A）。進(jìn)一步在人類蛋白質(zhì)圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)中也證明EC組織中的TTK水平遠(yuǎn)高于鄰近的正常組織（圖2E）。使用qRT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)均證明TTK在EC細(xì)胞系中的表達(dá)量更高（圖2G，H）。

3. 對(duì)EC中TTK基因的突變和表觀遺傳分析

根據(jù)TCGA中EC的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，比較了TTK高表達(dá)組和TTK低表達(dá)組的突變情況（圖4A）。Fisher檢驗(yàn)的結(jié)果表明兩組的突變譜存在顯著差異（圖4C），同時(shí)TP53突變?cè)赥TK高組中顯著富集，突變頻率高達(dá)53%（圖4D）。并且，作者發(fā)現(xiàn)TTK高組中擴(kuò)增和缺失的拷貝數(shù)變異(CNV)數(shù)量明顯高于TTK低組（圖4F）。

圖4?對(duì)EC中TTK基因的突變分析

為了探索與TTK失調(diào)相關(guān)的表觀遺傳改變，作者進(jìn)行了EC患者和對(duì)照組間的全基因組甲基化比較分析，發(fā)現(xiàn)位于啟動(dòng)子區(qū)域的59個(gè)GpG位點(diǎn)被差異甲基化（圖5A、B)。對(duì)兩組間差異基因的關(guān)聯(lián)分析顯示7個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中兩個(gè)基因（ANG和C4BPB）表現(xiàn)出高甲基化和下調(diào)，五個(gè)基因（BRINP1、KLHL1、NOL4、SLC6A15和PKIA)顯示低甲基化和上調(diào)。甲基化和基因表達(dá)的相關(guān)性分析表明，這七個(gè)基因的基因表達(dá)受位于啟動(dòng)子區(qū)域的CpG位點(diǎn)的甲基化調(diào)節(jié)（圖5C、D）。生存分析表明，兩個(gè)高甲基化和下調(diào)基因的低表達(dá)與EC患者較短的總生存期相關(guān)（圖5E、F）。

圖5?對(duì)EC中TTK基因的表觀分析

5. 與TTK差異表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞亞群分析

作者分析了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中包含5個(gè)EC樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，共鑒定出10個(gè)細(xì)胞亞群（圖6A、B）。作者以內(nèi)皮細(xì)胞作為參照，分析上皮細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和增殖細(xì)胞的CNV水平（圖6C）。結(jié)果表明，三種類型的上皮細(xì)胞在1號(hào)染色體長(zhǎng)臂均有擴(kuò)增，與TCGA中的EC樣本一致。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)CDCA8、FAM83D、RACGAP1和TTK等基因主要在增殖細(xì)胞中表達(dá)（圖6D），表明增殖細(xì)胞亞群可能與腫瘤惡性增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖6與TTK差異表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞亞群分析

6. 抑制TTK基因可降低EC細(xì)胞的EMT

為了驗(yàn)證TTK基因的功能，作者將HEC-1細(xì)胞的TKK基因敲低，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和侵襲水平降低（圖7A-C），并且，TTK敲低顯著增加了HEC-1細(xì)胞對(duì)TX的敏感性（圖7D）。將TTK過表達(dá)時(shí)，Ishikawa細(xì)胞的增殖、侵襲和對(duì)TX的抗性持續(xù)增強(qiáng)（圖7A-D）。除了細(xì)胞表型外，TTK還影響EMT過程（圖7E）。經(jīng)過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，TTK的表達(dá)與CK-18、BMI-1和EZH2水平相關(guān)（圖7F）。

圖7?抑制TTK基因可降低EC細(xì)胞的EMT

文章小結(jié)

這篇文章對(duì)?“單基因分析”進(jìn)行了新的拓展，圍繞一個(gè)基因，進(jìn)行了多組學(xué)、多維度的分析。限于篇幅，一些結(jié)果和圖片未能展示完全，需要完整內(nèi)容的粉絲，可以在原文中獲取。單基因分析的可用場(chǎng)景是非常多的，可以側(cè)重臨床應(yīng)用的模型構(gòu)建，或者是基礎(chǔ)研究方向的，比如拓展待測(cè)基因的各種可能的延伸信息，既可以充實(shí)背景，也可以擴(kuò)充數(shù)據(jù)，進(jìn)行找補(bǔ)，用來講述一個(gè)更加完整的故事。不論是項(xiàng)目開題（碩士、博士），還是國(guó)自然前期基礎(chǔ)延伸，或者是功能基因的功能試驗(yàn)，都具有重要作用。

如果你還苦惱于生信沒有思路，或者嫌分析方法太過簡(jiǎn)單、太過老套，想要?jiǎng)?chuàng)新思路的，或者對(duì)新的熱點(diǎn)方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧。

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