寫在前面

????????今天推薦的是由山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院在2021年5月20日發(fā)表于Nature Communications（2020IF：14.919，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Chengjiang Gao教授，研究表明USP18通過促進MAVS的K63連接的多聚泛素化正向調(diào)節(jié)先天抗病毒免疫。

研究背景

????????MAVS的激活是Rig-I樣受體(RLR)信號傳導(dǎo)中的一種銜接分子，對于抗病毒免疫是必不可少的，但調(diào)節(jié)MAVS激活的分子機制尚不完全清楚。泛素化在調(diào)節(jié)MAVS的活性方面具有核心功能。

摘要部分

????????在這里，作者證明了線粒體定位的去泛素化酶USP18與MAVS特異性相互作用，促進K63連接的多聚泛素化和隨后的MAVS聚集。USP18上調(diào)仙臺病毒(SeV)或腦心肌炎病毒(EMCV)感染后I型干擾素的表達和產(chǎn)生。缺乏USP18的小鼠更容易受到RNA病毒感染。USP18作為支架蛋白發(fā)揮作用，促進TRIM31的重新定位并增強TRIM31與線粒體中MAVS之間的相互作用。作者的結(jié)果表明，USP18作為MAVS介導(dǎo)的抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的翻譯后調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用。

研究內(nèi)容

1.USP18增強MAVS的多聚泛素化??? ? ?

????????由于MAVS特異性定位于線粒體外膜，并受到泛素化修飾的廣泛調(diào)節(jié)，作者推測線粒體中存在的DUB可以與E3泛素連接酶合作，嚴(yán)密調(diào)節(jié)MAVS的泛素化水平。作者利用PsortWolf軟件發(fā)現(xiàn)13個DUB可能分布在線粒體中。為了尋找參與MAVS泛素化調(diào)節(jié)的DUB，作者將編碼HA-泛素(Ub)、MAVS和13個DUB的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。通過用HA抗體探測免疫沉淀物來檢查MAVS的多聚泛素化水平。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)與其他DUB相比，USP18顯著增強而不是降低了MAVS的多聚泛素化水平。對于其余的DUB可能從廣泛的底物中去除了泛素,不具有線粒體特異性。

????????USP18是一種干擾素誘導(dǎo)基因，受LPS28刺激。作者探究了RNA病毒感染期間USP18的表達，發(fā)現(xiàn)SeV感染大大增加了人THP-1細(xì)胞中的人USP18 mRNA和USP18蛋白。為了研究USP18是否與線粒體相關(guān)，作者從THP-1細(xì)胞中分離了線粒體，發(fā)現(xiàn)USP18在SeV感染后確實富含線粒體部分。更重要的是，作者觀察到在RNA病毒感染后，USP18的蛋白質(zhì)水平在線粒體中增強，而不是在ER中增強。

研究結(jié)論：USP18是一種線粒體相關(guān)蛋白，可能通過促進MAVS泛素化參與抗病毒先天免疫的調(diào)節(jié)。

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2.USP18在RNA病毒感染時調(diào)節(jié)IFN-β信號? ? ?

????????為了探索USP18在抗病毒信號傳導(dǎo)中的潛在作用，作者在THP-1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性mRNA的表達和USP18的蛋白質(zhì)水平在用USP18特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中比在用對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中低得多。USP18表達的siRNA敲低顯著降低SeV感染后THP-1細(xì)胞中IFNB mRNA和下游CCl5 mRNA的表達。類似于用THP-1細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)，作者觀察到原代小鼠巨噬細(xì)胞中Usp18表達的siRNA敲低降低了SeV和EMCV誘導(dǎo)的Ifnb表達和IFN-β的產(chǎn)生。由于SeV和EMCV分別被RIG-I和MDA5識別，這種現(xiàn)象表明USP18調(diào)節(jié)RIG-I和MDA5介導(dǎo)的先天抗病毒信號。? ? ?

????????接下來，作者從Usp18+/+和Usp18-/-小鼠制備了原代腹膜巨噬細(xì)胞。與Usp18+/+巨噬細(xì)胞相比，具有SeV的巨噬細(xì)胞導(dǎo)致Ifnb mRNA，Ccl5m mRNA以及IFN-β的產(chǎn)生減少。Usp18-/-.的感染與WT對應(yīng)物相比，EMCV誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞還導(dǎo)致Ifnb及其下游Ccl5基因mRNA水平以及IFN-β的產(chǎn)生減少。從小鼠分離MEF細(xì)胞也觀察到同樣的結(jié)果。

????????作者接下來研究了USP18對RLR介導(dǎo)的I型干擾素反應(yīng)的影響是否與IFNAR相關(guān)。作者用抗IFNAR抗體預(yù)處理MEF細(xì)胞以阻斷IFN下游基因的誘導(dǎo)。作者觀察到用IFNAR抗體預(yù)處理仍然導(dǎo)致Usp18+/+和Usp18-/-細(xì)胞之間存在顯著差異。此外，作者發(fā)現(xiàn)用小鼠重組IFN-β預(yù)處理MEF細(xì)胞會導(dǎo)致Usp18+/+和Usp18-/-細(xì)胞之間的差異。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明I型IFN和IFNAR部分促進了USP18對RLR介導(dǎo)的信號的調(diào)節(jié)作用。

研究結(jié)論：USP18在SeV和EMCV感染后正向調(diào)節(jié)IFN-β信號。

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3.USP18調(diào)節(jié)RNA病毒感染

????????為了研究USP18在調(diào)節(jié)病毒感染中的作用，作者在感染SeV后使用MEF細(xì)胞中的SeV抗體測量SeV病毒蛋白。與USP18調(diào)節(jié)IFN-β信號的功能相一致， Usp18-/-MEFs與Usp18+/+?MEFs相比，SeV的病毒蛋白水平有所提高。此外，USP18在HEK293T細(xì)胞中的過表達導(dǎo)致pIRF3水平增加，并以劑量依賴性方式降低SeV水平。作者隨后構(gòu)建了Usp18+/+和Usp18-/-帶有VSV-GFP的小鼠。通過ELISA分析，作者發(fā)現(xiàn)感染VSV后，Usp18-/-小鼠血清中IFN-β的產(chǎn)生明顯低于Usp18+/+小鼠。此外，作者觀察到Usp18小鼠在感染后出現(xiàn)更嚴(yán)重的癱瘓癥狀，大腦中的VSV滴度也相應(yīng)提高。作者還觀察到，在Usp18-/-小鼠的脾臟、肝臟和肺部，VSV的滴度和VSV-GFP蛋白都明顯高于Usp18+/+小鼠。此外，Usp18-/-與Usp18+/+小鼠相比，小鼠對VSV感染的抵抗力較差，表現(xiàn)出明顯的生存時間減少。不僅如此，蘇木精-安地紅染色顯示，相對于Usp18+/+小鼠的肺部，感染VSV后，Usp18-/-小鼠的肺部有更大的免疫細(xì)胞浸潤和損傷。

研究結(jié)論：USP18在抗RNA病毒感染的抗病毒先天性免疫中起著重要作用。

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4.USP18在RLR信號通路中與MAVS相互作用

????????由于USP18是一種線粒體相關(guān)蛋白并且可以增加MAVS泛素化，作者認(rèn)為USP18可以靶向MAVS以調(diào)節(jié)針對RNA病毒的抗病毒先天免疫。為了研究USP18是否與MAVS特異性相互作用，作者利用Co-IP測定來檢查RLR信號通路中的信號分子與USP18之間的相互作用。結(jié)果顯示USP18主要與MAVS相互作用。作者發(fā)現(xiàn)USP18與MAVS中173aa至573aa的片段相互作用。免疫熒光測定顯示Myc-USP18表現(xiàn)出與Flag-MAVS的共定位。USP18和MAVS之間的空間共定位和相互作用通過PLA進一步證實，其中紅點顯示USP18和MAVS之間相互作用的數(shù)量。當(dāng)Myc-USP18與對照Flag載體共轉(zhuǎn)染時沒有紅點，而Myc-USP18和Flag-MAVS的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致大量紅點。值得注意的是，作者還觀察到在THP-1細(xì)胞中SeV感染后USP18和MAVS之間的內(nèi)源性相互作用增強，表明USP18可能在調(diào)節(jié)MAVS的活性中發(fā)揮作用。這種增強的USP18和MAVS復(fù)合物形成通過PLA測定得到進一步驗證。由于MAVS位于線粒體中，作者進一步分離了線粒體部分，并觀察到SeV感染后線粒體中MAVS和USP18之間的相互作用增強。

研究結(jié)論：USP18主要針對RLR信號通路中的MAVS。

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5.USP18增強了MAVS的K63連接的多聚泛素化和聚集? ? ?

????????接下來，作者研究了USP18是否特異性調(diào)節(jié)MAVS的泛素化水平，作者將編碼USP18、泛素的質(zhì)粒與RLRs通路中的信號分子一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。作者觀察到USP18僅增強MAVS的泛素化水平，表明其在RLR途徑中對MAVS泛素化的特異性調(diào)節(jié)。與之前的研究一致，作者的結(jié)果顯示USP18過表達導(dǎo)致STING泛素化減少。作者接下來檢查了USP18促進的MAVS中的泛素連接類型。作者觀察到USP18增強了MAVS的K63連鎖而不是K48連鎖的多聚泛素化。

????????接下來，作者通過免疫沉淀和串聯(lián)泛素化結(jié)合實體(TUBE)測定分析了USP18對內(nèi)源性MAVS泛素化的影響。與USP18過表達的結(jié)果一致，RAW264.7細(xì)胞中USP18的siRNA敲低導(dǎo)致K63連接的泛素化MAVS減少。作者還觀察到Usp18-/-MEF與Usp18+/+MEF相比，在病毒感染后顯示出顯著更少的K63連接的多聚泛素化。如前所述，MAVS的K63連接的多聚泛素化促進其聚集，這是激活下游信號傳導(dǎo)的先決條件。鑒于USP18增強了MAVS的K63連接的多聚泛素化，作者接下來檢查了USP18是否可以促進MAVS的聚集。SDD-AGE分析表明，與對照Myc載體相比，USP18的過表達導(dǎo)致更多的MAVS聚集體形成。此外，作者觀察到USP18與MAVS在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致更多的MAVS聚集，表現(xiàn)出線粒體骨架長度和細(xì)胞溶膠面積減少。另一方面，與SeV感染后的Usp18+/+MEF相比，MEF顯示出MAVS聚集減少。

研究結(jié)論：在RNA病毒感染期間，USP18促進了MAVS的K63相關(guān)泛素化和聚集。

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6.USP18獨立于酶活性調(diào)節(jié)MAVS的泛素化

????????鑒于USP18是DUB，但可以有效提高MAVS的多聚泛素化水平，作者提出了兩種可能的方案。首先，USP18可以穩(wěn)定和增加MAVS的E3泛素連接酶的蛋白質(zhì)水平，這取決于其酶活性。其次，USP18作為銜接蛋白為MAVS募集E3泛素連接酶，而不是依賴其酶活性。為了測試這些可能，作者將USP18的半胱氨酸殘基64突變?yōu)榻z氨酸（USP18 C64S）使其失去酶活。作者觀察到MAVS和USP18之間的相互作用不受該突變的影響。此外，作者觀察到USP18 C64S可以像野生型USP18一樣增強MAVS的K63連接的多聚泛素化。一致地，通過SDD-AGE和免疫熒光測定，USP18 C64S導(dǎo)致MAVS的聚集程度與野生型USP18相當(dāng)。作者還發(fā)現(xiàn)將USP18和USP18 C64S轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中導(dǎo)致磷酸化IRF3增加，隨后SeV蛋白以劑量依賴性方式減少。

研究結(jié)論：USP18增強了MAVS的K63連接的多聚泛素化和抗病毒先天免疫反應(yīng)，而與其酶活無關(guān)。

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7.USP18促進MAVS的K63連接多聚泛素化依賴于E3連接酶TRIM31

????????作者認(rèn)為USP18可能會招募E3連接酶用于MAVS的K63連接的多聚泛素化。TRIM31是唯一已鑒定的E3連接酶，可催化MAVS的K63連接的多聚泛素化。因此，作者研究了USP18對MAVS泛素化的影響是否依賴于TRIM31。作者觀察到在HEK293T細(xì)胞中敲低TRIM31導(dǎo)致USP18抑制增強的K63連接的MAVS泛素化。此外，在Trim31+/+?MEF中USP18的過度表達導(dǎo)致MAVS的K63連接的多聚泛素化增強。為了進一步描述USP18和TRIM31在調(diào)節(jié)MAVS泛素化方面的關(guān)系，作者在TRIM31有無存在的情況下敲低了USP18。作者觀察到在TRIM31存在下敲低USP18可以降低MAVS的K63連接的多聚泛素化水平，表明USP18的功能介導(dǎo)MAVS的K63連接的多聚泛素化是上游并依賴于TRIM31。作者之前的研究已經(jīng)確定TRIM31在MAVS的賴氨酸殘基11、311和461處催化K63連接的多聚泛素化。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)與WT MAVS相比，USP18不能增強MAVSK11R、K311R和K461R的K63連接的多聚泛素化。此外，作者發(fā)現(xiàn)在SeV感染后用WT MAVS而不是MAVS 3KR重建的MAVS KO HeLa中，USP18的敲低可能導(dǎo)致IFNB、CCL5和CXCL10的減少，表明USP18調(diào)節(jié)RLR介導(dǎo)的I型干擾素反應(yīng)通過調(diào)節(jié)TRIM31催化的MAVS泛素化。

研究結(jié)論：USP18促進MAVS的K63連接多聚泛素化依賴于E3連接酶TRIM31。

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8.USP18促進線粒體中MAVS和TRIM31之間的相互作用? ? ?

????????作者假設(shè)USP18與TRIM31相互作用，隨后增強了TRIM31和MAVS之間的相互作用。為了驗證作者的假設(shè)，作者首先探究了USP18和TRIM31之間是否存在相互作用。通過Co-IP測定和免疫熒光分析，表明USP18和TRIM31之間的相互作用。更重要的是，作者觀察到內(nèi)源性USP18和TRIM31之間的相互作用在SeV感染后增加，表明USP18可能控制TRIM31的活性。此外，作者觀察到USP18、TRIM31和MAVS通過Co-IP測定形成復(fù)合物，表明USP18可能充當(dāng)MAVS和TRIM31之間的支架蛋白。? ? ?

????????作者認(rèn)為USP18將TRIM31招募到線粒體中以促進TRIM31和MAVS之間的相互作用。與之前的研究一致，作者觀察到在SeV感染后，TRIM31在Usp18+/+?MEF中的線粒體中有效富集。然而，這種富集在Usp18-/-?MEF中顯著受損，表明USP18對TRIM31易位至線粒體至關(guān)重要。作者還觀察到病毒感染后MAVS和TRIM31之間的相互作用在Usp18-/-中顯著受損。此外，USP18的過表達可以以劑量依賴性方式增強MAVS和TRIM31之間的相互作用。

研究結(jié)論：USP18作為支架將TRIM31募集到線粒體中，以促進MAVS泛素化和聚集，從而調(diào)節(jié)抗病毒先天免疫。

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結(jié)論與討論

????????綜上所述，作者已經(jīng)確定了一種去泛素酶USP18是在RNA病毒感染期間調(diào)節(jié)MAVS聚集的宿主因子。病毒感染后，USP18在線粒體中富集，并促進線粒體中TRIM31從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)出，以及TRIM31和MAVS之間的相互作用，從而增強TRIM31介導(dǎo)的K63連接的多聚泛素化和隨后的MAVS的聚集。作者的研究闡明了MAVS聚集的調(diào)節(jié)機制,強調(diào)了其在先天抗病毒反應(yīng)中的重要性。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23219-4