? 華東理工大學(xué)藥學(xué)院??

葫蘆素B誘導(dǎo)GRP78-FOXM1-KIF20A通路介導(dǎo)的

結(jié)膜黑色素瘤細(xì)胞G2-M細(xì)胞周期停滯

01?前言

結(jié)膜黑色素瘤 (Conjunctival Melanoma，CM) 是一種罕見且致命的黑色素細(xì)胞惡性腫瘤，位于眼表。它約占所有眼部腫瘤的2%和所有非皮膚黑色素瘤的1.6%。CM在人群中發(fā)病率低，發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，潛伏期長，因此更難治愈。大多數(shù)CM源于原發(fā)性獲得性黑變病 (Primary acquired melanosis，PAM) 或結(jié)膜色素痣。但迄今為止，關(guān)于CM的遺傳和表觀遺傳特征還沒有更深入的闡明。

2022年10月，華東理工大學(xué)藥學(xué)院李劍教授與上海九院眼科徐曉芳/賈仁兵教授團(tuán)隊(duì)合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）上發(fā)表了題為“Cucurbitacin B-induced G2-M cell cycle arrest of conjunctival melanoma cells mediated by GRP78–FOXM1–KIF20A pathway”的研究論文，揭示了葫蘆素B能夠抑制結(jié)膜黑色素瘤直接靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。

https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.05.021

02?葫蘆素B

葫蘆素B (CuB)是最豐富和最常研究的葫蘆素衍生物之一，它是從葫蘆科植物中分離出來的四環(huán)化合物。作為一種傳統(tǒng)藥物，CuB具有多種藥理活性，如抗炎、解熱、抗糖尿病和抗癌活性，這些活性由不同的調(diào)節(jié)信號(hào)通路介導(dǎo)。在中國，CuB已被用作慢性肝炎和原發(fā)性肝癌的輔助治療藥物。在此研究中，作者通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)第一次發(fā)現(xiàn)CuB能夠顯著抑制具有典型NRAS和BRAF突變（包括CRMM2、CM-AS16、CRMM1 和 CM2005.1）的CM細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞無毒性。

03?親和力檢測(cè)

為了確定CuB的直接作用靶點(diǎn)，作者采用ABPP（Activity-Based Protein Profiling）的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略，篩選到GRP78蛋白鑒定為潛在靶標(biāo)。GRP78已被驗(yàn)證為多種癌癥的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，可抑制癌細(xì)胞的進(jìn)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。接下來作者需要通過直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明篩選得到的GRP78蛋白為CuB的直接靶點(diǎn)。

作者首先通過熱位移（TSA）結(jié)合測(cè)定證明，與對(duì)照相比，使用CuB處理過的樣品(0.2 mmol/L) 以溫度依賴性方式增加細(xì)胞裂解物中GRP78的熱穩(wěn)定性（圖1），表明GRP78和CuB之間可能存在直接相互作用。

之后，評(píng)估CuB與GRP78的親和力，團(tuán)隊(duì)使用了NanoTemper的Monolith NT. Automated分子互作儀進(jìn)行MST檢測(cè)，結(jié)果顯示CuB與GRP78的親和力為0.11 μmol/L（圖2，紅色曲線），與細(xì)胞活性一致。MS/MS分析表明，在經(jīng)過CuB處理的重組GRP78樣品中，GRP78的Lys326位點(diǎn)存在α-β--不飽和酮修飾。作者檢測(cè)CuB與突變體 GRP78 (Lys326Ala) 的親和力明顯減弱，其Kd值為 25.40 μmol/L（圖2，藍(lán)色曲線）。綜合其他實(shí)驗(yàn)，證明了CuB通過α-β-不飽和酮部分與GRP78相互作用。

04?MST技術(shù)

在此項(xiàng)研究中，NanoTemper的MST技術(shù)在小分子化合物（CuB）- 蛋白質(zhì)（GRP78）相互作用的檢測(cè)中提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證明了二者之間存在直接的相互作用，促進(jìn)了結(jié)膜黑色素瘤的靶向療法的臨床研究。

Monolith系列分子互作儀基于MST技術(shù)，覆蓋幾乎任何分子類型、緩沖液成分或親和力強(qiáng)弱的檢測(cè)項(xiàng)目，并且檢測(cè)不依賴于分子量，蛋白用量少，對(duì)于蛋白聚集耐受度高，能夠輕松應(yīng)對(duì)不同類型的分子間相互作用檢測(cè)難題，助力癌癥靶點(diǎn)研究。