研究背景

tau蛋白細(xì)胞內(nèi)積累是阿爾茨海默?。ˋD）和相關(guān)tau病的標(biāo)志性病理學(xué)，因此靶向tau蛋白可能有望用于藥物開發(fā)。蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）是一種從細(xì)胞內(nèi)選擇性降解蛋白質(zhì)的新型藥物發(fā)現(xiàn)策略。PROTAC（C004019）通過(guò)促進(jìn)其在具有穩(wěn)定tau過(guò)表達(dá)（hTau）的HEK293細(xì)胞中的泛素化-蛋白酶體依賴性蛋白水解以及過(guò)表達(dá)hTau的SH-SY5Y誘導(dǎo)了強(qiáng)大的tau清除。

本篇由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系王建枝教授研究團(tuán)隊(duì)在Theranostics期刊（IF:11.600）發(fā)表的“A novel small-molecule PROTAC selectively promotestau clearance to improve cognitive functions inAlzheimer-like models”的文章，文章發(fā)現(xiàn)了一種新的藥物C004019能夠靶向tau，用于從細(xì)胞內(nèi)選擇性降解蛋白質(zhì)，同時(shí)招募tau和E3連接酶（Vhl），選擇性增強(qiáng)tau蛋白的泛素化和蛋白水解。

研究發(fā)現(xiàn)C004019通過(guò)促進(jìn)其泛素化-蛋白酶體依賴性蛋白水解，在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定或短暫過(guò)度表達(dá)hTau，誘導(dǎo)tau的清除。單劑量和多劑量皮下注射C004019可顯著降低野生型、hTau轉(zhuǎn)基因和AD小鼠大腦中的tau水平，改善突觸和認(rèn)知功能，這為AD及相關(guān)tau蛋白疾病提供了一種有希望的候選藥物。

文章速遞

1、C004019通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)不同細(xì)胞模型中的tau清除

PROTAC（C004019）分子量為1，035.29Da（圖1A-B）。通過(guò)CCK8測(cè)定在具有野生型全長(zhǎng)人tau（稱為HEK293-hTau）穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞中測(cè)試了分子的毒性（圖1C）。C004019處理誘導(dǎo)HEK293-hTau中多個(gè)AD相關(guān)位點(diǎn)的總tau（Tau5）和tau磷酸化（p-tau）的濃度依賴性降低（圖1D-E）和SH-SY5Y（圖1F-I）細(xì)胞也是同樣的檢測(cè)結(jié)果。不同劑量給藥發(fā)現(xiàn)到10μM的C004019可以有效地降低p-tau和總tau水平（圖1H-I）。免疫熒光染色檢測(cè)了總蛋白和p-tau蛋白的C004019濃度依賴性清除率（圖1J），研究顯示C004019沒有顯著改變tau的mRNA水平（圖1L）。同時(shí)，C004019處理顯著提高了tau的泛素化水平（圖1K）。通過(guò)用蛋白酶體抑制劑MG132同時(shí)處理HEK293-hTau細(xì)胞，消除了C004019誘導(dǎo)的tau清除（圖1M-N）。

2、腦室內(nèi)給藥C004019促進(jìn)野生型和3xTg小鼠體內(nèi)tau清除

腦室內(nèi)輸注C004019在24 h誘導(dǎo)的海馬tau減少最顯著，并且在48 h時(shí)減少仍然非常顯著，盡管略小于24 h（圖2A-B）。在大腦皮層中，僅在48小時(shí)而不是24小時(shí)檢測(cè)到tau的顯著減少（圖2C-D）。腦室內(nèi)給藥C004019降低了海馬體和皮質(zhì)中的總tau和p-tau水平（圖2E-J）。確認(rèn)C004019的特異性，作者測(cè)量了另一種微管相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白MAP2的蛋白質(zhì)水平。C004019在4月齡野生型和9.5月齡3xTg-AD小鼠中均未改變MAP2水平（圖2A-H）。

3、單劑量皮下給藥C004019誘導(dǎo)野生型小鼠大腦中的tau清除

在皮下給予15 mg/kg的C004019后24 h和48 h，在海馬體和皮質(zhì)中檢測(cè)到tau蛋白顯著減少（圖3A-C）。出乎意料的是，皮下給予低劑量C004019（3mg / kg）24小時(shí)在海馬和皮質(zhì)中誘導(dǎo)的tau減少比高劑量（15mg / kg）更顯著（圖3D-F）。單劑量施用C004019（3mg / kg）誘導(dǎo)tau蛋白持續(xù)減少至8天，盡管顯示tau水平隨時(shí)間恢復(fù)的趨勢(shì)（圖3D-F）。測(cè)試C004019胃內(nèi)強(qiáng)飼法（20mg / kg，48h）的效果，但沒有檢測(cè)到明顯的tau減少（圖3G-J）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦組織最大濃度C004019與血漿最大濃度（Kpuu值）之比為0.00866（圖3K）。

4、多劑量皮下給藥C004019可促進(jìn)hTau和3xTg-AD小鼠的tau清除，改善認(rèn)知和突觸功能

C004019給藥后第48天處死小鼠（圖4A)，與載體對(duì)照相比，不頻繁皮下給藥C004019顯著降低了海馬提取物中的總和p-tau水平（圖4B-C）。同時(shí)觀察到不頻繁的皮下遞送C004019可以減少可溶性和不溶性tau，更有效地減少可溶性部分中的tau（圖4D-G）。免疫組織化學(xué)染色也顯示 C004019 處理組的 p-tau 和 tau 聚集減少（圖4H-I）。不頻繁的皮下注射C004019顯著減輕了小鼠的認(rèn)知缺陷，表現(xiàn)為在新型物體識(shí)別（NOR）測(cè)試中探索新物體的時(shí)間增加（圖4L），并改善了恐懼條件（FC）測(cè)試中的凍結(jié)指數(shù)（圖4M），以及在六天的學(xué)習(xí)試驗(yàn)期間找到平臺(tái)或在莫里斯水迷宮（MWM）測(cè)試的探測(cè)試驗(yàn)期間到達(dá)平臺(tái)象限的延遲降低（圖4N-P）。C004019組海馬DG神經(jīng)突起化和脊柱密度較載體對(duì)照顯著增加（圖4Q-R）。數(shù)據(jù)表明不頻繁地皮下給藥C004019可以改善hTau轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的認(rèn)知功能和樹突可塑性。

進(jìn)一步的研究表明，C004019顯著降低了海馬和皮質(zhì)提取物中的可溶性和不溶性tau水平，有效地降低了可溶性部分中的tau（圖5A-H）使用T22發(fā)現(xiàn)C004019顯著降低了可溶性級(jí)分中的T22陽(yáng)性tau（圖5I-L）。由于~110 KDa處的條帶不夠暗（圖（圖5I，5IK左圖），作者通過(guò)更長(zhǎng)的曝光來(lái)增強(qiáng)波段（圖5I，5K右圖），使用pS404和AT8的免疫組織化學(xué)染色和硫黃素S染色顯示C004019處理組中p-tau蛋白和聚集tau蛋白的減少（圖5M-Q）。染色未發(fā)現(xiàn)對(duì)淀粉樣蛋白β斑塊有顯著影響（圖5R-S）。數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)不頻繁的皮下給藥C004019可以促進(jìn)AD小鼠tau蛋白的清除。

與年齡匹配的S129對(duì)照相比，3xTg小鼠在NOR測(cè)試中的辨別指數(shù)降低，而C004019治療幾乎完全恢復(fù)了記憶能力（圖6B-C）。在MWM測(cè)試中，與載體處理的3xTg小鼠相比，用C004019處理的3xTg小鼠在6天的學(xué)習(xí)試驗(yàn)中到達(dá)平臺(tái)的延遲更短，平臺(tái)交叉和目標(biāo)區(qū)域交叉增加（圖6D-H），表示C004019對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶的拯救。在FC試驗(yàn)中，C004019處理恢復(fù)了3xTg小鼠的冷凍指數(shù)（圖6I）。3xTg-AD小鼠的脊柱數(shù)量減少，LTP誘導(dǎo)受損，而不頻繁的皮下給藥C004019恢復(fù)了脊柱密度（圖6K-L）和LTP感應(yīng)，包括fEPSP幅度和斜率（圖6M-O），但對(duì)神經(jīng)突起樹化沒有任何影響（圖6J）。數(shù)據(jù)證實(shí)C004019的外周給藥確實(shí)可有效改善3xTg-AD小鼠的認(rèn)知和突觸功能。

研究結(jié)論

tauPROTAC可以選擇性地有效地誘導(dǎo)tau清除，并在不同的hTau細(xì)胞模型以及AD樣hTau和3xTg轉(zhuǎn)基因小鼠中顯著改善突觸和認(rèn)知功能。

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