細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞統(tǒng)計(jì)是與各種不同細(xì)胞樣本類型廣泛研究中的關(guān)鍵因素。

本文提供了七個(gè)重要點(diǎn)和方法，來提高我們細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性、并確?？芍貜?fù)性，無論是手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)還是需要使用自動(dòng)化系統(tǒng)，如：自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

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1.?清潔細(xì)胞計(jì)數(shù)板表面

無論使用任何細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，確保樣品表面清潔至關(guān)重要，因?yàn)槿魏挝廴径伎赡軒聿粶?zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)需要對玻璃蓋玻片進(jìn)行清理（如果選?。?strong>BIOFOUNT一次性一體式多孔細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可以避免污染問題），首先，使用70%乙醇清洗計(jì)數(shù)腔，然后用潔凈水進(jìn)行沖洗。使用一次性塑料計(jì)數(shù)板，每個(gè)樣品需要一個(gè)新的計(jì)數(shù)腔（同一細(xì)胞腔室不能重復(fù)使用）。

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器，腔室的精度非常重要，其次是使用過程中細(xì)胞懸浮液加樣腔不能出現(xiàn)氣泡。

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2.?裝載前立即混合

在向細(xì)胞計(jì)數(shù)腔體內(nèi)加載細(xì)胞懸浮液前對懸浮液進(jìn)行搖勻和混合至關(guān)重要。搖勻和混合是確保所測定的樣品完全具有代表性（圖2）。

不同大小和類型的細(xì)胞將以不同的速率聚集和沉淀。在裝載樣品之前混合溶液可確保等分試樣均勻并準(zhǔn)確反映細(xì)胞培養(yǎng)物的特性。

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3.?最小化單元格聚集

細(xì)胞計(jì)數(shù)前需要對整個(gè)原液的小樣本進(jìn)行評估，因此需要注意，確保細(xì)胞樣本可以代表原始原液培養(yǎng)物。

雖然細(xì)胞計(jì)數(shù)儀需要通過復(fù)雜的軟件算法來識團(tuán)聚的單個(gè)細(xì)胞，但細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是沒有能力對非代表性樣本進(jìn)行校正。當(dāng)采用手動(dòng)計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)員之間的可變性也很大，主要是細(xì)胞聚團(tuán)后的估算通常比單個(gè)細(xì)胞更具主觀性。

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細(xì)胞成團(tuán)通常是由細(xì)胞外DNA和細(xì)胞裂解后的細(xì)胞碎片引起的。細(xì)胞裂解可能是由過度生長、冷凍/解凍循環(huán)、進(jìn)行機(jī)械剪切以及胰蛋白酶消化不足或過度等因素引起的，當(dāng)然也可能產(chǎn)生異質(zhì)性樣品。

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通過防止細(xì)胞裂解的原因或者采取過濾樣品中的細(xì)胞碎片，可以顯著減少細(xì)胞團(tuán)聚問題出現(xiàn)。

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4.?優(yōu)化設(shè)置

無論是依靠軟件算法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，還是采用顯微鏡手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，對聚焦點(diǎn)和曝光設(shè)置來確保細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中的最佳視角，以獲得最準(zhǔn)確細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果同樣重要。

圖2-最佳對焦：正確對焦（左）和對焦不良的圖像（右）

根據(jù)實(shí)際情況對聚焦和曝光應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到細(xì)胞膜和背景之間的鮮明對比（圖2和圖3）。

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??圖3-正確曝光（左）、曝光過度（中）、曝光不足（右）

對于熒光應(yīng)用，需要單獨(dú)優(yōu)化每個(gè)熒光通道確保可以得到可重復(fù)的計(jì)數(shù)結(jié)果。熒光強(qiáng)度的設(shè)置需確保細(xì)胞處于盡可能亮的水平，同時(shí)保持其真實(shí)大小。細(xì)胞邊緣不應(yīng)有任何光線溢出。

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5.?正確選擇腔室高度

市面有很多不同品牌和形式的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，每種細(xì)胞計(jì)數(shù)板的深度和網(wǎng)格設(shè)計(jì)各不相同，在進(jìn)行計(jì)算時(shí)一定要注意使用正確計(jì)算方法和選擇有精準(zhǔn)的細(xì)胞強(qiáng)度深度的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，以避免出現(xiàn)錯(cuò)誤。

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6.?細(xì)胞計(jì)數(shù)參數(shù)調(diào)整

大多數(shù)自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀都有對細(xì)胞大小、光源亮度以及細(xì)胞性狀進(jìn)行設(shè)置，以便與要統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞樣本進(jìn)行匹配。例如：可以設(shè)置要測量的細(xì)胞大小范圍，以便將碎片或其他細(xì)胞群體排除在統(tǒng)計(jì)之外。

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7.?明場或熒光的選擇

明廠分析可以是非常有效的統(tǒng)計(jì)細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)手段。然而，僅應(yīng)用臺盼藍(lán)有時(shí)候難以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并且對于許多原代細(xì)胞或計(jì)數(shù)分離的細(xì)胞核，采用熒光計(jì)數(shù)可能是更加準(zhǔn)確。

例如：外周血單核細(xì)胞（PBMC）通常與大量紅細(xì)胞（RBCs）混合，使用明場分析，這些紅細(xì)胞可能看起來是“死亡”細(xì)胞。

然而，使用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）等染料，可以單獨(dú)染色有核的PBMC，并通過使用雙熒光能力區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和無核細(xì)胞或碎片。

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AO和PI都可以對核酸進(jìn)行染色，但只有AO具有穿透活細(xì)胞膜的能力。因此，活PBMC被AO染色并呈熒光綠色；死亡的PBMC用AO和PI染色并發(fā)熒光。RBCs和碎片保持未染色且完全不顯示熒光。

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技術(shù)文章源于：BIOFOUNT耗材公司