盡管單細(xì)胞技術(shù)為惡性腫瘤中單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和動態(tài)進(jìn)化提供了見解， 但由于空間組織信息的丟失，單細(xì)胞分析只能提供細(xì)胞相互作用的間接推斷。在大腦中，空間組織和功能密切相關(guān)。因此，在空間分辨的背景下全面研究由于微環(huán)境而導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤的各種轉(zhuǎn)錄適應(yīng)極具必要性。

2022年6月，來自德國弗賴堡大學(xué)的研究團(tuán)隊在Cancer Cell（IF 50.3）雜志上發(fā)表題為“Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma”的研究文章，該研究揭示了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的空間生態(tài)位受到腫瘤微環(huán)境的影響，對炎癥或代謝刺激產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄適應(yīng)，并概括了不同的神經(jīng)發(fā)育階段。

?研究材料

腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織冰凍切片；不同年齡段人、大鼠皮質(zhì)區(qū)切片誘導(dǎo)的皮質(zhì)類器官

?技術(shù)路線

步驟1：繪制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的空間水平轉(zhuǎn)錄圖譜；

步驟2：探究由空間決定的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性；

步驟3：空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序與亞克隆結(jié)構(gòu)；

步驟4：聯(lián)合空間代謝組揭示GBM中與反應(yīng)性缺氧相關(guān)的代謝改變；

步驟5：TCGA和缺氧相關(guān)CNA改變的細(xì)胞培養(yǎng)驗證；

步驟6：建立缺氧應(yīng)激概念以及逃逸機(jī)制的說明；

步驟7：腫瘤-宿主在反應(yīng)性免疫區(qū)域相互依賴的探索；

步驟8：體外皮層培養(yǎng)顯示了環(huán)境影響的雙向轉(zhuǎn)移。

?研究結(jié)果

1. 繪制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的空間水平轉(zhuǎn)錄圖譜

作者對來自20位患者的28個膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，得到了不同年齡組和不同解剖區(qū)域的88,793個Spot為單位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。此外，作者還對同類型的組織切片進(jìn)行了空間代謝組學(xué)(n=6)和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(n=14)，來從多組學(xué)角度綜合探究GBM的空間生物信息變化。在基于相互最近鄰(MNN)的水平整合和共享最近鄰域(SNN)的聚類后，觀察到非惡性的組織特性在患者之間表現(xiàn)為相似的，而惡性細(xì)胞的表達(dá)在患者間存在明顯的異質(zhì)性。

隨后，利用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的分割技術(shù)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)模型，對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用了去卷積的處理，在所有樣本的88,793個Spot中，觀察到63,121個Spot來自惡性細(xì)胞，其中46,459個Spot包含至少95%的腫瘤細(xì)胞。根據(jù)組織學(xué)分類系統(tǒng)預(yù)測了每個Spot的組織學(xué)表型，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞占比低的樣本主要是因為包含浸潤區(qū)域而導(dǎo)致的。

2. 探究由空間決定的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

作者根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄特征和細(xì)胞周期模塊對所有Spot進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)被分類為神經(jīng)元發(fā)育和反應(yīng)性缺氧相關(guān)的Spot在定義為周期細(xì)胞中被檢測的豐度較低，其他轉(zhuǎn)錄模塊則較平均的分布于所有細(xì)胞周期狀態(tài)。再進(jìn)一步將目前幾個公開的Bulk RNA-seq、scRNA-seq數(shù)據(jù)集與該研究中的stRNA-seq進(jìn)行了空間加權(quán)回歸整合，證實與神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)的程序放射狀膠質(zhì)、空間OPC和神經(jīng)元發(fā)育分別與AC-，OPC-和NPC-like有著較強(qiáng)的重疊。

作者發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性免疫程序與“混合”細(xì)胞群的關(guān)聯(lián)性是在空間上所獨有的，這些“混合”細(xì)胞群跨越AC和MES-like狀態(tài)，或與包含AC和MES-like狀態(tài)的細(xì)胞相靠近。此外，作者還分析了組織學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄集群之間的空間一致性，發(fā)現(xiàn)在組織學(xué)壞死區(qū)域周圍，反應(yīng)性缺氧程序顯著富集。

拷貝數(shù)改變(CNAs，包括癌基因的局灶性擴(kuò)增或腫瘤抑制因子的缺失)是惡性細(xì)胞的標(biāo)志， CNAs的改變可驅(qū)動治療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。作者利用推斷的CNAs事件研究了基因組改變和空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)性缺氧相關(guān)的Spot中出現(xiàn)了作為獨立的亞克隆事件CNAs的顯著積累。

3. 空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序和亞克隆結(jié)構(gòu)

為了探究空間上的轉(zhuǎn)錄多樣性是否可以直接反映腫瘤內(nèi)的遺傳亞克隆，作者通過患者特異性CNAs的層次聚類重建了克隆結(jié)構(gòu)，并確定了每個亞克隆內(nèi)個體間和空間上不同轉(zhuǎn)錄模塊的分布，在26.32%的亞克隆中，單一轉(zhuǎn)錄程序占主導(dǎo)地位(每個亞克隆的Spot超過75%)。這說明，克隆結(jié)構(gòu)對空間上不同的轉(zhuǎn)錄程序的發(fā)生沒有顯著影響，但亞克隆也會偶爾偏好于空間OPC(8.77%)或反應(yīng)性缺氧程序(10.52%)。

4. GBM中與反應(yīng)性缺氧相關(guān)的代謝改變

將空間代謝組數(shù)據(jù)與stRNA-seq數(shù)據(jù)的整合分析，識別出三個顯著的代謝亞組。功能代謝分析顯示，磷酸戊糖通路在第一個代謝模塊(M-G1)中顯著富集， M-G2的特征是磷酸腺苷代謝的富集，這也是膠質(zhì)瘤代謝的標(biāo)志； M-G3在糖酵解和氨基糖代謝方面顯著富集。

通過WNN聚類發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)中反應(yīng)性低氧的空間轉(zhuǎn)錄組模塊作為一個獨特的集群出現(xiàn)，被分配到反應(yīng)性缺氧通路的大多數(shù)Spot位于壞死組織的邊緣。作者聯(lián)系之前觀察到的空間CNAs分布分析結(jié)果，認(rèn)為低氧代謝導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性會在空間分離的生態(tài)位中積累，代表了新發(fā)生的基因組改變的潛在來源，而且這些改變可能利于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生治療耐藥性。

5. TCGA和缺氧相關(guān)CNA改變的細(xì)胞培養(yǎng)驗證

為了進(jìn)一步驗證以上發(fā)現(xiàn)，作者分析了來自TCGA數(shù)據(jù)庫的樣本(IDH1/2基因型GBM患者，n=357)，并根據(jù)缺氧基因表達(dá)評分對患者進(jìn)行了分類。缺氧驅(qū)動的腫瘤顯示了染色體改變的顯著增加，這證實了前文的觀察結(jié)果，并進(jìn)一步證實了代謝和基因組不穩(wěn)定性之間的關(guān)系。為了該假設(shè)，在常氧和低氧條件下培養(yǎng)了原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系2-6周(n=4)?？截悢?shù)變異揭示了CNA譜的差異，慢性缺氧條件下CNA事件的顯著累積證實了應(yīng)激誘導(dǎo)CNA改變的假設(shè)。

6. 缺氧應(yīng)激概念和逃逸機(jī)制的說明

研究觀察到特別是S期阻滯在缺氧核心點中很明顯，因此作者又進(jìn)一步提出了以下假設(shè):缺氧導(dǎo)致的S期阻滯導(dǎo)致了基因組不穩(wěn)定性的積累，即應(yīng)激反應(yīng)和有絲分裂檢查點的改變導(dǎo)致了細(xì)胞非整倍體性。作者估算出空間基因表達(dá)軌跡的目的，從而能夠識別空間上相反的轉(zhuǎn)錄通路，發(fā)現(xiàn)缺氧反應(yīng)和遷移特征顯示出反向的空間軌跡。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，代謝變化和氧化應(yīng)激是基因組多樣性的潛在相互驅(qū)動因素，從而導(dǎo)致GBM的克隆進(jìn)化。

7. 腫瘤-宿主在反應(yīng)性免疫區(qū)域相互依賴的探索

對于空間蛋白質(zhì)組，在反應(yīng)性免疫和反應(yīng)性缺氧程序的區(qū)域內(nèi)選擇ROI（感興趣的區(qū)域），并從分類為神經(jīng)元分化的區(qū)域中選擇空白對照ROI (n=6例患者，14個不同的1,000 μm2 ROI)，在分割后獲得了一個包含82,179個細(xì)胞的全面蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。作者通過將細(xì)胞細(xì)分為放射狀膠質(zhì)(EGFR+HOPX+)，反應(yīng)性免疫(EGFR+CHI3L1+VIM+)，空間OPC(EGFR+OLIG1+)，神經(jīng)發(fā)育(EGFR+SNAP25+-CALM2+)和反應(yīng)性缺氧(EGFR+VEGFA+)來量化細(xì)胞多樣性。反應(yīng)性免疫(EGFR+CHI3L1+VIM+)細(xì)胞僅在轉(zhuǎn)錄定義的反應(yīng)性免疫定位中得到證實。

為了補充關(guān)于免疫系統(tǒng)和GBM之間的細(xì)胞關(guān)系，作者建立了細(xì)胞相互依賴模型，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與淋巴樣或髓樣細(xì)胞的距離量化了它們之間的細(xì)胞連接，以此來證實在反應(yīng)性免疫區(qū)域中，腫瘤細(xì)胞與免疫區(qū)域之間的細(xì)胞相互作用存在著增強(qiáng)。

8. 體外皮層培養(yǎng)顯示了環(huán)境影響的雙向轉(zhuǎn)移

為了評估各種微環(huán)境的影響，作者采集了來自多個不同年齡患者的腦皮質(zhì)組織(2-85歲，患者n=3;切片n=48，每個患者16個)以及2周和2歲大鼠的供體(n=32個)切片。觀察到發(fā)育狀態(tài)相關(guān)的表達(dá)特征(OPC-，AC-和NPC-like)在人供體組織培養(yǎng)中的細(xì)胞中過表達(dá)，而且主要出現(xiàn)在青年和中年供體中(2/3)。在嚙齒類動物神經(jīng)環(huán)境中培養(yǎng)的GBM細(xì)胞富集了MES-1/2和AC-like轉(zhuǎn)錄特征。發(fā)育狀態(tài)的周期細(xì)胞僅在OPC-like亞群中檢測到。RNA Velocity顯示，從體外細(xì)胞培養(yǎng)初始狀態(tài)到類似MES和AC的末段狀態(tài)的預(yù)計向量方向代表了細(xì)胞變化由神經(jīng)環(huán)境而驅(qū)動并產(chǎn)生定向適應(yīng)。蛋白酪氨酸磷酸酶受體Z1型(PTPRZ1)作為膠質(zhì)細(xì)胞徑向分化的常見標(biāo)志基因，在MES-AC雜合狀態(tài)下的細(xì)胞軌跡中被分配為高度參與了這一細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。該數(shù)據(jù)證實了在OPC-和NPC-like分支中的雙向命運。編碼鉀離子通道(KCNH8)和代謝型谷氨酸受體(GRM3)的基因也在這些轉(zhuǎn)錄模塊中表現(xiàn)出高度參與了該細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，表明神經(jīng)元環(huán)境促進(jìn)了特定的轉(zhuǎn)錄偏好轉(zhuǎn)變，也與目前關(guān)于神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤相互作用的研究報道一致。

?小編小結(jié)

在過去的幾年中，通過單細(xì)胞分析技術(shù)的進(jìn)步所取得的許多發(fā)現(xiàn)徹底改變了人們對腫瘤異質(zhì)性和可塑性，以及潛在治療方案的理解。然而，腦腫瘤內(nèi)空間組織的生物學(xué)意義尚不清楚。該研究闡明了GBM的空間轉(zhuǎn)錄模式圖譜，并繪制了包括代謝和腫瘤-宿主細(xì)胞相互作用的微環(huán)境景觀，揭示了微環(huán)境和GBM轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的時空變化之間的雙向和單向相互作用。

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