背景

炎癥作為個體防御機(jī)制之一的先天免疫，適度反應(yīng)有利于清除病原微生物和修復(fù)受損組織，但過度的炎癥會導(dǎo)致進(jìn)一步的組織受損甚至危害生命。炎癥一般可分為炎癥激活、炎癥消退以及組織修復(fù)、穩(wěn)態(tài)重構(gòu)三個階段。而整個炎癥通路又由誘導(dǎo)因子、感受器、中介因子和效應(yīng)因子組成。炎癥信號一旦被誘導(dǎo)劑觸發(fā)，促進(jìn)如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6等的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生并參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在炎癥的不同階段發(fā)揮著不同的作用。其中IL-1家族中的IL-1β是典型的促炎細(xì)胞因子，其表達(dá)受到雙信號的嚴(yán)格控制。起始信號可以誘導(dǎo)無生物活性pro-IL-1β的表達(dá)，激活信號則能夠激活炎癥小體，隨后成熟的Caspase-1將pro-IL-1β切割成有生物活性的IL-1β并分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。據(jù)報道，在沒有激活信號的情況下，IL-1β的加工和釋放效率低下，大部分新合成的產(chǎn)物留在細(xì)胞內(nèi)，而這個過程由pro-IL-1β的泛素化調(diào)控。此外，IL-1β能夠誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，并通過與受體IL-1RI結(jié)合，進(jìn)而招募適配器MyD88/IRAK/TRAF6/NF-kB，形成信號級聯(lián)。

Cyclophilin A（CypA）是一種由PPIA基因編碼的在各種組織中廣泛存在的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶，參與流感病毒復(fù)制、抗病毒天然免疫及流感病毒繼發(fā)的細(xì)菌共感染。有報道稱，CypA能夠通過調(diào)控RIG-I/MAVS/NF-κB信號通路和IL-6反式信號通路促進(jìn)IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，但CypA在炎癥的不同階段發(fā)揮怎樣的作用仍然未知。孫蕾和劉文軍研究員帶領(lǐng)團(tuán)隊十多年來對CypA進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，就CypA在炎癥激活、炎癥消退以及組織修復(fù)過程中的作用及其作用機(jī)制進(jìn)行了深入探討，并在Cell Reports上，發(fā)表了題為“Delicate regulation of?IL-1β-mediated inflammation by cyclophilin A”的研究進(jìn)展。接下來我們就跟著楊文賢博士來看看，促炎因子CypA的研究都用到了哪些材料與方法。

從Ppia-/-小鼠模型確定炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵細(xì)胞因子?

作者從Jackson實驗室購買了Ppia-/-小鼠，與野生型小鼠（WT）一起，經(jīng)過脂多糖（LPS）0、6h、12h、24h、3d、5d、7d的誘導(dǎo)，形成了不同時間點(diǎn)的小鼠肺炎模型。首先通過組織病理學(xué)染色實驗（圖1A），對不同時間點(diǎn)小鼠的肺部切片進(jìn)行了病理性評分（圖1B），同時，對相同時間點(diǎn)的肺干濕質(zhì)量變化（圖1C）和肺指數(shù)（圖1D）進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)他們的結(jié)果驚人相似，由此說明Ppia編碼的CypA在炎癥的不同階段發(fā)揮著不同的作用。

由于細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，為了檢測這些細(xì)胞因子在炎癥模型中的表現(xiàn)情況，作者分別提取了Ppia-/-和WT小鼠肺部、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、血清中的mRNA，通過qPCR、ELISA以及免疫組化實驗，分別檢測了肺部細(xì)胞因子Il1b（圖1E），以及BALF（圖1F）、血清（圖1G）和肺部（圖1H和圖1I）的分泌細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)WT小鼠不同部位中這兩個細(xì)胞因子在6h、12h、24h時的表達(dá)量均高于Ppia-/-小鼠，而到3d、5d、7d后的表達(dá)量出現(xiàn)了反轉(zhuǎn)。除此以外，作者還檢測了其他細(xì)胞因子在不同部位的表達(dá)量。總而言之，所有實驗結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型中，CypA主要通過調(diào)節(jié)IL-1β的表達(dá)量來控制其在炎癥不同階段中的作用。

關(guān)鍵細(xì)胞因子在肺炎典型細(xì)胞系中的機(jī)理研究

（1）LPS誘導(dǎo)的炎癥早期階段中，CypA的促進(jìn)作用

為了進(jìn)一步確定CypA為什么能在炎癥早期促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，首先查閱文獻(xiàn)可知，CypA可以通過調(diào)節(jié)NF-κB中的p65來促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這里作者選擇了經(jīng)典的小鼠原代細(xì)胞系——骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM），人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和炎癥研究的人源經(jīng)典細(xì)胞系THP-1（THP-1/PPIA-/-?細(xì)胞由源井提供），通過CRIPR-Cas9、干擾等方法，獲得對應(yīng)的PPIA敲除或敲降的突變細(xì)胞系。隨后，通過LPS對這些WT和突變細(xì)胞系進(jìn)行處理來模擬肺炎，分別在0、2h、4h、6h、8h檢測并比較了在小鼠模型中檢測過的細(xì)胞因子Il1b或IL1B的mRNA表達(dá)量（圖S2A-C）；又通過免疫印跡，分析了0、4h、8h、12h時CypA、pro-IL-1β的蛋白表達(dá)量（圖S2D-F），以及0、15min、30min、60min時磷酸化的p65的表達(dá)量（圖S2G-I）。由此說明，CypA是通過增加p65的磷酸化水平來提高Il1b和IL1B的表達(dá)，以及pro-IL-1β的含量。為了進(jìn)一步確定CypA是怎么促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，作者對CypA的PPIase活性功能域進(jìn)行了突變（R55A），檢測了與PPIA敲除細(xì)胞系相同的成分（S2J-L），顯示出與PPIA敲除時一致的結(jié)果，由此說明，在炎癥早期階段，CypA介導(dǎo)的IL-1β表達(dá)的增強(qiáng)需要其酶的活性。

THP-1基因編輯細(xì)胞作為研究免疫和炎癥的典型工具細(xì)胞，卻時常面臨轉(zhuǎn)染難、單克隆生長率低等困難，源井生物歷經(jīng)上百例真實項目摸索總結(jié)，對THP-1細(xì)胞的基因編輯體系進(jìn)行針對性優(yōu)化，大幅提升THP-1的基因編輯成功率，助您進(jìn)行疾病的病理生理學(xué)研究和高通量藥物篩選，可復(fù)制鏈接進(jìn)入官網(wǎng)了解詳情?。╤ttps://www.ubigene.com/）

根據(jù)前人研究結(jié)果可知，IL-1β最初是作為一種不活躍的促細(xì)胞因子（pro-IL-1β）合成的，一旦二級信號被激活，pro-IL-1β則被NLRP3/ASC/caspase-1炎性小體切割成有活性的IL-1β。因此，作者進(jìn)一步研究了CypA是否對pro-IL-1β的加工具有影響。首先通過在BMDM/Ppia-/-（圖2A）、THP-1/PPIA-/-（圖S3A）、A549/CypA-（圖S3B）模型中的ELISA實驗可知，當(dāng)ATP刺激炎癥小體激活時，CypA突變型細(xì)胞系中IL-1β的表達(dá)是顯著低于對應(yīng)WT細(xì)胞系的。

（2）LPS誘導(dǎo)的炎癥消退階段中，CypA的抑制作用

有報道指出，在沒有如ATP的二級信號的刺激下，IL-1β的加工和釋放是低效的，且大多數(shù)合成的產(chǎn)物都被留在細(xì)胞內(nèi)，要么不被處理，要么被降解。為了探究CypA為什么能在炎癥晚期階段抑制IL-1β的表達(dá)，作者隨后研究了CypA對pro-IL-1β穩(wěn)定性的影響。首先還是利用免疫印跡法，直接檢測了BMDM/Ppia-/-（圖2B）、THP-1/PPIA-/-（圖S3C）、293T/CypA-、模型中pro-IL-1β的表達(dá)量，結(jié)果表明，CypA能加速上述三個WT細(xì)胞中內(nèi)源pro-IL-1β的降解。隨后，將帶有FLAG標(biāo)簽的pro-IL-1β表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到293T，并用DMSO、MG132和NH4Cl處理（圖2C），比較發(fā)現(xiàn)，MG132能促進(jìn)pro-IL-1β的降解，由此說明pro-IL-1β的降解是由泛素-蛋白酶體途徑降解，且這個過程不依賴于CypA的PPIase活性（圖S3E）。

（3）CypA影響pro-IL-1β泛素化

有研究報道，K63連接泛素化的pro-IL-1β對炎性小體的激活和IL-1β的分泌具有重要作用。因此，為了驗證CypA是否影響pro-IL-1β的泛素化，作者實施了泛素化實驗，通過免疫印跡的方法，在293T和BMDM細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在沒有ATP刺激下，CypA對pro-IL-1β的K48連接泛素化具有顯著影響（圖2D、圖S3F），但當(dāng)ATP單獨(dú)作用時，CypA則逐漸增加pro-IL-1β的K63連接泛素化（圖2E、圖S3G）。

（4）pro-IL-1β關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)驗證

為了進(jìn)一步驗證pro-IL-1β的關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)，通過質(zhì)譜分析，找到了K73、K132、K143這三個潛在的泛素化位點(diǎn)。免疫印跡實驗證明，K73R、K132R和K143R突變導(dǎo)致pro-IL-1β的K48連接泛素化減少，而K132R、K143R突變導(dǎo)致pro-IL-1β的K63連接泛素化減少（圖2F）。仍不能確定哪個才是pro-IL-1β加工的關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)。于是作者將NLRP3、ASC和caspase-1與pro-IL-1β的野生型或突變型共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并用ATP刺激，通過免疫印跡（圖2G）和ELISA（圖2H）實驗發(fā)現(xiàn)，K143R突變會阻止pro-IL-1β剪切成活性的IL-1β，從而判斷K143是pro-IL-1β加工的關(guān)鍵位點(diǎn)。隨后再次通過免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染了編碼野生型pro-IL-1b-myc及其不同突變基因載體的293T（圖2I），發(fā)現(xiàn)K132和K143是pro-IL-1β降解的關(guān)鍵位點(diǎn)。

?綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在炎癥激活期，有高濃度ATP的刺激下，CypA主要通過增強(qiáng)K143位點(diǎn)的K63連接泛素化來促進(jìn)pro-IL-1β的加工；而在炎癥緩解期，低濃度ATP環(huán)境下，CypA主要通過促進(jìn)pro-IL-1β在K132和K143位點(diǎn)處K48泛素化來加速pro-IL-1β的降解。

當(dāng)然，作者的研究不止步于此，后續(xù)利用類似的方法，通過精心的實驗設(shè)計與對比，對IL-1β誘導(dǎo)的炎癥模型進(jìn)行了更加系統(tǒng)的研究，揭示了CypA加劇IL-1β誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制，闡明了CypA在IL-1β誘導(dǎo)的II型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)肺修復(fù)中作用，為未來對與炎癥相關(guān)疾病的治療提供了更系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，及相關(guān)靶點(diǎn)篩選的方向。

在作者的研究中我們可以看到，幾乎所有的研究方法里都用到了大量的基因敲除細(xì)胞系，工欲善其事必先利其器，現(xiàn)成優(yōu)質(zhì)的敲除細(xì)胞系則是加快研究進(jìn)展的利器。源井近3000種KO細(xì)胞系現(xiàn)貨，覆蓋8大信號通路和40種疾病，如本文使用的THP-1、A549、293T，可為科學(xué)研究提供豐沛的資源和服務(wù)，快至1周交付，可復(fù)制鏈接入庫搜索?>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=16