甲基化在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、X染色體失活、胚胎發(fā)育、衰老以及疾病的發(fā)生起著極其重要的作用。近日，Illumina推出了 Infinium Methylation EPIC v2.0（Illumina 935K甲基化芯片），該產(chǎn)品是Illumina Methylation EPIC v1.0（illumina 850K甲基化芯片）的升級(jí)版本，該芯片包括超過(guò)935,000個(gè)CpG位點(diǎn)，最大限度地兼容Illumina 850K甲基化芯片的情況下，935K甲基化芯片在原850K甲基化芯片的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)評(píng)估，將850K甲基化芯片中性能較差的探針移除和替換。同時(shí)增加了186000個(gè)CpG位點(diǎn)，包含靶向增強(qiáng)子、超級(jí)增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)、CNV檢測(cè)區(qū)域以及850K甲基化芯片上未充分覆蓋的CpG島和常見的癌癥驅(qū)動(dòng)突變。此外，935K甲基化芯片還增加了經(jīng)ATAC-Seq和ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)鑒定的染色質(zhì)開放區(qū)域，同時(shí)注釋基因版本從HG19更新到HG38以及GenoCode數(shù)據(jù)庫(kù)的更新，該款芯片不僅是適合篩選分子標(biāo)志物的一款芯片，同時(shí)也是一款適合復(fù)雜疾病基因組關(guān)聯(lián)分析研究的（EWAS）的最新款甲基化芯片。

中科普瑞/鯨舟基因用細(xì)胞系樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每一株細(xì)胞系進(jìn)行4重復(fù)，用于檢測(cè)Illumina 935K甲基化芯片的穩(wěn)定性，從illumina平臺(tái)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)、中科普瑞平臺(tái)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及差異分析等多方面驗(yàn)證這款新產(chǎn)品的適用性以及公司檢測(cè)的穩(wěn)定性。

01. Illumina芯片平臺(tái)常規(guī)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

在完成illumina 935K甲基化微珠芯片后，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GenomeStudio軟件，可以從Control Dashboard得到質(zhì)控微珠的數(shù)據(jù)。從實(shí)驗(yàn)操作，轉(zhuǎn)化和信號(hào)值3個(gè)方面對(duì)芯片進(jìn)行質(zhì)控。

以上3個(gè)方面可以看出雜交實(shí)驗(yàn)過(guò)程穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化率高、熒光信號(hào)和結(jié)合狀況良好，綜合說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定。

02. 中科普瑞芯片平臺(tái)常規(guī)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

935K甲基化芯片原始數(shù)據(jù)為idat文件，我們基于Champ包對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，獲得每個(gè)樣本的DNA甲基化位點(diǎn)β值，基于illumina芯片位點(diǎn)基于Beta矩陣表對(duì)I型探針和II型探針的校正，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控可視化圖的展示，主要從SVD批次校正圖、density圖、箱線圖、PCA圖，相關(guān)性熱圖、聚類圖6方面來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。

???SVD分析用于評(píng)估樣本數(shù)據(jù)中重要元素的變異程度。我們將EPIC芯片間的差異以及芯片上樣本的位置視為批間差，考慮到這可能會(huì)對(duì)后續(xù)分析產(chǎn)生影響，因此使用SVD分析。

從SVD校正之前和校正之后的圖我們可以看到，芯片的批間差（slide和position）對(duì)項(xiàng)目的差異結(jié)果是造成了影響，批間差校正使用Combat算法進(jìn)行。在校正后，再進(jìn)行一次SVD分析，查看校正后結(jié)果顯示芯片的批間差異校正，無(wú)批間差影響后續(xù)差異分析結(jié)果。

???Density圖，全基因組范圍的DNA甲基化變化是復(fù)雜疾病和腫瘤研究的熱點(diǎn)。我們通過(guò)繪制樣本β值密度曲線圖，查看不同分組的樣本DNA甲基化整體水平。

通常的β值密度曲線圖呈現(xiàn)“雙峰型”，即絕大部分的甲基化位點(diǎn)處于高甲基化和低甲基化的狀態(tài)，通過(guò)上圖我們可以看出該項(xiàng)目測(cè)試數(shù)據(jù)β密度曲線屬于正常的甲基化狀態(tài)，同時(shí)也看出4樣本重復(fù)性幾乎一致。

???箱線圖，我們使用箱線圖來(lái)表征各樣本β值數(shù)據(jù)分布的整體特征，包括中位值、P25、P75分位值。

通過(guò)箱線圖我們可以看出由于測(cè)試的是細(xì)胞系樣本，細(xì)胞系樣本的中位值、P25、P75分位值差別比較大，在正常組織、全血、細(xì)胞等樣本中的中位值、P25、P75分位值相差并不是很大，主要是由于細(xì)胞系樣本組成單一，受原代細(xì)胞影響，從另一方面也說(shuō)明了數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)結(jié)果也比較穩(wěn)定。

???PCA主成分分析是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的方法。能夠有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素或結(jié)構(gòu)，通過(guò)降噪和除冗余將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，并展示在二維的主成分圖上。在PCA圖中，距離越接近代表樣本的組成越相似。對(duì)于理想的實(shí)驗(yàn)分組，組間的樣本會(huì)出現(xiàn)分散的分布，而組內(nèi)則會(huì)出現(xiàn)聚集的情況。

在PCA圖的結(jié)果展示種我們知道距離越接近代表樣本的組成越相似，從上圖分析結(jié)果來(lái)看可以看出每個(gè)細(xì)胞系做了4重復(fù)實(shí)驗(yàn)，同組細(xì)胞系樣本聚類分群明顯。

???樣本相關(guān)性熱圖，樣本相關(guān)性熱圖用于展示樣本之間的相關(guān)性。通過(guò)計(jì)算兩兩樣本之間的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行作圖。圖中橫縱坐標(biāo)均為樣本，每一個(gè)點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)的這兩個(gè)樣本之間的相關(guān)性。顏色由藍(lán)到紅，表示兩個(gè)樣本間的相關(guān)性由低到高。顏色約紅，表示樣本相關(guān)性越高，那么整體甲基化模式越相似。

樣本相關(guān)性熱圖的分析我們知道顏色越紅代表樣本的組成越相似，從分析結(jié)果來(lái)看可以看出同一個(gè)細(xì)胞系做了4重復(fù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性極高。

???樣本聚類圖，樣本聚類分析主要展示所有樣本間的相似程度，樣本相似度越高的樣本越會(huì)被聚類到一個(gè)簇上。

通過(guò)聚類分析樣本的相似度，從結(jié)果來(lái)看可以看出同一個(gè)細(xì)胞系做了4重復(fù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性很高。