1.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

2.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

3.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5.何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum)則是指小牛血清。HS (horseserum)則是指馬血清。

6.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

7.何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

8.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9.附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于﹣20℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

10.懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

11.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過(guò)高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

12.細(xì)胞之接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。

13.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

14. DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級(jí)，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。

15.冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃30~60分鐘→(-20℃30分鐘*)→-80℃16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3℃至﹣80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20℃不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106?cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106?cells/ml vial為宜。

17.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

18.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？

加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。

19.支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。

20.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

21. CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每?jī)芍芤淮?以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

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