鐵死亡是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，小薇之前給大家介紹了幾個(gè)“單基因+通路+熱點(diǎn)細(xì)胞死亡”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)套路，那有小伙伴想研究藥物，不知道怎么著手，別著急，小薇今天以下面這篇文獻(xiàn)為例，四步教會(huì)大家設(shè)計(jì)“藥物+鐵死亡+疾病+通路”實(shí)驗(yàn)，一起往下來(lái)看吧~

第一步

??研究藥物對(duì)疾病的作用

首先作者展示了圣草酚的二維和三維結(jié)構(gòu)圖（圖1A和B）。接著用圣草酚處理卵巢癌細(xì)胞（CaoV3和A2780細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)CaoV3和A2780的細(xì)胞活力以圣草酚劑量依賴的方式降低（圖1C），此外，CaoV3的細(xì)胞凋亡以圣草酚劑量依賴性的方式顯著升高（圖1D）。說(shuō)明圣草酚抑制卵巢癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

第二步

???研究藥物對(duì)鐵死亡的影響

為了進(jìn)一步研究圣草酚對(duì)卵巢癌細(xì)胞鐵死亡的影響，本研究檢測(cè)了CaoV3和A2780細(xì)胞中的

Fe2+水平、ROS積累以及SLC7A11和GPX4的蛋白水平

（鐵死亡相關(guān)指標(biāo)）。首先，將細(xì)胞系用不同濃度的圣草酚處理，發(fā)現(xiàn)CaoV3和A2780細(xì)胞中的Fe2+水平增加（圖2A）。此外，Erastin（

鐵死亡誘導(dǎo)劑

）顯著增強(qiáng)了圣草酚對(duì)Fe2+水平的影響，F(xiàn)errostatin-1（

鐵死亡抑制劑

）挽救了其作用（圖2B）。并且圣草酚處理顯著增加了ROS的產(chǎn)生（圖2C）。為了進(jìn)一步證實(shí)圣草酚對(duì)鐵死亡的作用，檢測(cè)了SLC7A11和GPX4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)濃度為50和100 μM的圣草酚顯著降低了CaoV3和A2780細(xì)胞中SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)水平（圖2D）。這些結(jié)果表明，在CaoV3和A2780細(xì)胞中，圣草酚引發(fā)了鐵死亡。

接著作者進(jìn)一步研究圣草酚是否會(huì)影響卵巢癌細(xì)胞線粒體功能，利用流式細(xì)胞儀使用JC-1檢測(cè)試劑盒對(duì)MMP進(jìn)行測(cè)量 [紅色表示線粒體具有高（活性）值，綠色區(qū)域表示低（非活性）ΔΨm值]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)圣草酚降低了CaoV3和A2780細(xì)胞中JC-1熒光比（紅/綠）的比率（圖3A和B）。還檢測(cè)了GSH和MDA的水平以評(píng)估MMP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圣草酚顯著降低了GSH水平，但增加了MDA水平（圖3C和D）。并且，圣草酚提高了細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)（圖3E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CaoV3和A2780細(xì)胞中，圣草酚加重了線粒體功能障礙。

第三步

??藥物通過(guò)通路發(fā)揮作用

此外，作者進(jìn)一步研究了圣草酚對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，這部分選擇CaoV3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HO-1和NQO1是Nrf2下游基因，因此進(jìn)一步研究了圣草酚是否在CaoV3細(xì)胞的Nrf2信號(hào)通路中介導(dǎo)HO-1或NQO1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HO-1和NQO1的蛋白質(zhì)水平以及Nrf2磷酸化明顯被圣草酚下調(diào)，這被BM（甲基巴多索隆，Nrf2激活劑）處理部分挽救（圖4A和B）。此外，與對(duì)照組相比，BM處理增強(qiáng)了細(xì)胞活力（圖4C），但下調(diào)了Fe2+水平（圖4D）。還觀察到BM處理提高了GSH水平（圖4E），但降低了MDA含量（圖4F）。這些結(jié)果表明，圣草酚可能通過(guò)Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、鐵死亡和線粒體功能。

第四步

??體內(nèi)驗(yàn)證

最后，作者進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)探討了圣草酚對(duì)卵巢癌的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，圣草酚時(shí)間減少了腫瘤體積和體重（圖5A-C）。并且與對(duì)照組相比，圣草酚處理顯著降低了腫瘤重量的平均值（圖5D）。H&E染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，圣草酚明顯降低了腫瘤切片的染色強(qiáng)度（圖5E）。IHC分析顯示，圣草酚顯著降低了Nrf2的表達(dá)（圖5F）。此外，還發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，圣草酚顯著下調(diào)GSH水平，上調(diào)MDA水平（圖5G和H）。研究結(jié)果表明，圣草酚抑制腫瘤生長(zhǎng)，加重線粒體功能障礙，降低卵巢癌腫瘤組織中的Nrf2水平。

好啦，以上四個(gè)步驟簡(jiǎn)單吧，以文獻(xiàn)為例就比較好理解啦，都學(xué)會(huì)啦吧，有問(wèn)題的可以留言哈，快收藏起來(lái)吧~

沒(méi)有研究方向的小伙伴也不要著急，小薇這里還提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)服務(wù)，有需要的小伙伴隨時(shí)聯(lián)系小薇，小薇一直都在~