高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。其中，基于大規(guī)模并行測序（massively parallel sequencing，簡寫MPS）的DNA測序技術(shù)能夠在DNA納米陣列上以相對較低的成本提供數(shù)十億次讀取，并能實現(xiàn)多種基因組應(yīng)用。同時，通過進一步提高MPS測序的讀取長度、序列質(zhì)量和降低成本將使更經(jīng)濟實惠和準(zhǔn)確的全面健康監(jiān)測測試成為可能。

目前，MPS測序主要使用染料標(biāo)記的可逆終止核苷酸（dye-labeled reversibly terminated nucleotides，RTs），但是這些核苷酸（RTs）存在著以下一些缺點：合成成本高、結(jié)合效率低、每個堿基僅限定一種染料使產(chǎn)生的信號有限、以及會造成天然核苷酸的不完全再生（即在染料剪切后，染料連接物的一部分作為“疤痕”殘留在堿基上）。

因此，華大基因（BGI）及其在美國硅谷的子公司Complete Genomics Incorporated（CGI）開發(fā)了一種新穎的、更高效和準(zhǔn)確的MPS測序方法，稱為：COOLMPSTM（圖一）[1]。

圖一COOLMPSTM測序的概念于2016年由CGI提出，并申請了專利。其基本原理是在測序過程的每一個循環(huán)中，利用特異性識別單個核苷酸的熒光標(biāo)記抗體和3’端的天然核苷酸結(jié)合，阻斷DNA鏈的延伸并通過讀取不同的熒光信號，辨別不同的3’末端堿基類型；然后通過條件的改變，使結(jié)合在3'末端核苷酸上的熒光標(biāo)記抗體解離下來，讓天然核苷酸獲得再生，并在堿基上不留有“疤痕“，從而在新的測序循環(huán)中可以得到進一步延伸，而不受前一個循環(huán)的干擾（如圖二）。這種方法的優(yōu)點在于：未標(biāo)記的天然核苷酸更容易制備，成本更加低廉，并且因為在延伸過程中不產(chǎn)生“化學(xué)疤痕”，使其能夠更高效的和下一個核苷酸堿基整合；此外，因為針對單個核苷酸的特異性抗體上，可以標(biāo)記多個染料分子（如2-5個），和熒光標(biāo)記的核苷酸相比，能夠大大增強測序信號。

圖二

由此可見，為了使COOLMPSTM平臺能夠商業(yè)化并被廣泛應(yīng)用，針對單個核苷酸的、高特異性的單克隆抗體是關(guān)鍵。CGI自2017年開始即和優(yōu)睿賽思（Yurogen Biosystems）合作，致力于開發(fā)針對單個核苷酸的兔單克隆抗體；到2021年底為止，已經(jīng)成功為CGI前后開發(fā)了三代針對于單個核苷酸的高特異性兔單克隆抗體，最終定株的抗體通過大規(guī)模重組表達生產(chǎn)，成功應(yīng)用于CGI和華大基因推出的新一代基于COOLMPSTM的NGS測序試劑盒[2,3]。

下面以dATP為例來分享對于單核苷酸單克隆抗體的開發(fā)經(jīng)驗。毫無疑問，針對單核苷酸類半抗原（Hapten），需要將其偶聯(lián)到KLH、BSA等carrier蛋白上進行免疫（圖三）；其免疫周期相對于一般的蛋白免疫也要長。相對于小鼠等嚙齒類動物，兔子獨特的免疫系統(tǒng)對半抗原有更好的免疫應(yīng)答，經(jīng)過9周左右的免疫周期，便獲得針對dATP較理想的滴度（圖三）。為了更加準(zhǔn)確的評價血清有效抗體的滴度，優(yōu)睿賽思合成了用生物素（biotin）長臂（PEG）偶聯(lián)的dATP，結(jié)合親和素（streptavidin）預(yù)處理的96孔板來進行滴度檢測，結(jié)果顯示：在多抗血清階段，經(jīng)KLH-dATP免疫的兔血清，對于dCTP、dGTP、dTTP仍舊存在著一定的交叉反應(yīng)。

圖三

基于此，為了獲得高親和力以及高特異性的dATP兔單克隆抗體，首先，優(yōu)睿團隊對兔子進行一次KLH-dATP加免，收集脾臟細胞進行單B細胞分選后同時利用生物素標(biāo)記的dATP對兔子脾臟細胞進行抗原特異性B細胞富集并加入了大量無生物素標(biāo)記的dCTP、dTTP、dGTP進行封閉；然后，對分選的抗原特異性B細胞進行體外培養(yǎng)，一周后取上清針對生物素偶聯(lián)的dATP進行高通量的ELISA篩選，同時針對生物素偶聯(lián)的dCTP、dTTP和dGTP進行負篩選。經(jīng)過這個流程，在免疫完成后兩周之內(nèi)即獲得了58株特異性結(jié)合dATP的陽性克?。▓D四）。

最后，CGI根據(jù)這些陽性克隆針對dATP的ELISA讀數(shù)，以及dCTP、dTTP和dGTP的交叉反應(yīng)率，從中選取了8株陽性克隆進行基因克隆并重組表達，四周之后即獲得了超過1mg的重組兔抗dATP單克隆抗體；經(jīng)優(yōu)睿生物通過ELISA初步驗證之后，特異性與B細胞上清階段的篩選基本一致。CGI將交付的重組單克隆抗體熒光標(biāo)記之后，在COOLMPSTM上進行最終的質(zhì)檢測試，并選取表現(xiàn)最佳的2株重組兔單克隆抗體（圖四），作為新型NGS測試試劑盒的重要組成成分。

圖四

綜上所述，利用兔子作為宿主動物，結(jié)合優(yōu)睿賽思的SMab?單細胞篩選平臺，在開發(fā)針對小分子抗原的高特異性兔單克隆抗體上，具有巨大的優(yōu)勢：

1.經(jīng)研究表明，動物的免疫系統(tǒng)對小分子半抗原（包括多糖類、化合物、核苷酸和翻譯后修飾等），并不是通過經(jīng)典的MHC I和MHC II途徑進行抗原呈遞，而是通過CD1分子；兔子擁有四種CD1亞家族蛋白，而嚙齒類動物（如小鼠）一般只具備兩種（圖五）[4]，從而使兔子對于小分子抗原的呈遞效率大大提高，增強對其的免疫反應(yīng)。

圖五

2.SMab?平臺主要通過抗原特異性富集來篩選B淋巴細胞，使得篩選后細胞的陽性率大大提高；同時，還可以通過在富集階段，進行負篩選、阻斷等方法來去除非特異性結(jié)合的B淋巴細胞，來提高獲得特異性B細胞克隆的幾率。
3.SMab?平臺的核心是對單個B淋巴細胞進行體外培養(yǎng)，上清中表達高達10 ug/mL的兔IgG保證各種篩選正常進行，包括基于ELISA方法的負篩選、競爭ELISA、阻斷ELISA等，以及流式細胞分析、Western Blot分析等；通過這些分析，可以在非常早期就可以鎖定特異性陽性克隆，大大減少后期克隆、表達和驗證的工作量。如果通過常規(guī)的單B細胞篩選和克隆的方法，需要將多達幾百個從單B細胞中獲取的抗體基因，再在體外進行重組表達驗證，而最終可能也就獲得幾株所需要的高特異性抗體，但所涉及的工作量、交付時間和費用等都將大大增加。

優(yōu)睿賽思自2015年成立起，已為國內(nèi)外知名企業(yè)交付了多達幾百個高度定制的、針對小分子半抗原的兔單克隆抗體定制項目，針對靶點包括（不限于）：翻譯后修飾（磷酸化、甲基化）、小分子化合物（包括極低免疫原性的聚二乙醇，PEG）、單個核苷酸、mRNA、siRNA以及多糖（Glycan）等。

近年來，抗體偶聯(lián)藥物（antibody drug conjugates，ADCs）在國內(nèi)外市場日益趨熱，針對ADC上細胞毒性分子（play load，往往是小分子）的高特異性單克隆抗體，是每一款A(yù)DC藥物在臨床試驗中進行藥物動力學(xué)（pK）檢測所必須的。著眼未來，面向全球市場優(yōu)睿賽思將攜手國內(nèi)外合作伙伴共同深耕更多First-in-Class和Best-in-Class的抗體，為人類生命健康做出更多貢獻。

參考文獻：

1.CoolMPSTM: Advanced massively parallel sequencing using antibodies specific to each natural nucleobase. bioRxiv preprint doi:10.1101/2020.02.19.953307.

2.CoolMPS for robust sequencing of single-nuclear RNAs captured by droplet-based method. Nucleic Acids Res. 2021 Jan 25;49(2)

3.CoolMPS: evaluation of antibody labeling based massively parallel non-coding RNA sequencing. Nucleic Acids Res. 2021 Jan 25;49(2).

4.Lipid and Small Molecule Display by CD1 and MR1. Nat Rev Immunol. 2015 October ; 15(10): 643–654.