背景介紹

小鼠黑色素瘤細胞B16-F10是來源于C57BL/6J小鼠自發(fā)性腫瘤細胞，它在顯微鏡下呈成纖維細胞樣，僅需接種少量細胞，便可在數(shù)天后形成克隆，由此可見B16-F10細胞的增殖能力很強。另外它還具有侵襲性強，成瘤率高等特點，被認為是?構建腫瘤模型理想的細胞，幾乎所有科研人員建立腫瘤模型時會考慮使用B16-F10細胞。近年來，黑色素瘤發(fā)病率逐年上升，惡性黑色素瘤（malignant melanoma，ＭＭ）是皮膚黑色素細胞來源的惡性腫瘤，具有轉移快、預后差、生存期短等特點，據(jù)統(tǒng)計晚期黑色素瘤患者平均生存期短于1年，5年生存率低于10%。因此常用于構建小鼠黑色素瘤細胞模型的B16-F10細胞，對黑色素瘤轉移和治療的研究具有重要意義[1]。

源井生物提供適用于各類基因編輯的野生型B16-F10細胞，能更好地構建小鼠黑色素瘤細胞模型，并且我們還提供能穩(wěn)定表達Luciferase熒光蛋白的B16-F10-Luc細胞用于活體成像等。

B16-F10細胞的具體應用

1.體內追蹤和轉移

B16-F10 細胞起源于小鼠產(chǎn)生黑色素的上皮細胞，移植后很容易在體內追蹤。因此B16-F10細胞成為研究轉移途徑的有效工具。目前許多項目利用B16-F10 細胞研究細胞對疫苗的免疫反應、miRNA 介導的轉移特性，尤其是miR-21（腫瘤抑制因子和抗增殖因子的侵略者）。

2.重要的腫瘤模型

多年來，癌癥研究人員通過開發(fā)適當且準確的動物疾病模型取得了重大進展，其中最重要的是可移植的嚙齒動物腫瘤。在癌癥研究中的腫瘤模型中，B16-F10成為了癌癥研究的重要的研究模型。

CRISPR/Cas9技術在B16-F10細胞中的應用

CRISPR/Cas9已成為一種強大的工具來改造基因組并激活或抑制基因的表達。因此，在癌癥研究中，CRISPR/Cas9 技術是剖析腫瘤發(fā)生機制和發(fā)現(xiàn)藥物開發(fā)新靶點的有效工具。黑色素瘤是最具侵襲性的皮膚癌，盡管癌基因靶向藥物和免疫檢查點抑制劑在提高患者總體生存率方面取得了重大成功，但相關毒性和新出現(xiàn)的耐藥性仍是持續(xù)的挑戰(zhàn)。于是基因療法成為了一種有吸引力的選擇，可以提高目前可用的黑色素瘤療法的療效，從而改善患者的預后。研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2 經(jīng)常在惡性黑色素瘤中表達，其表達與患者的不良生存率顯著相關，因此Ercolano等人采用 CRISPR/Cas9 技術研究前列腺素內過氧化物合酶2 (PTGS2) 在黑色素瘤發(fā)生和轉移中的作用。他們利用CRISPR/Cas9 技術將B16-F10細胞中的PTGS2敲除，發(fā)現(xiàn)PTGS2在黑色素瘤細胞中的表達降低后不僅會抑制B16-F10細胞的增殖、遷移和侵襲，還能通過削弱髓源性抑制細胞分化來調節(jié)免疫反應，最終有效抑制了體內腫瘤的發(fā)生和轉移。這些現(xiàn)象表明了PTGS2可以作為黑色素瘤的靶向治療基因，對于新的高選擇性黑色素瘤治療藥物的開發(fā)具有重要意義。[2]

圖 1 PTGS2基因的基因表達分析

CRISPR/Cas9技術在B16-F10細胞中的具體案例

1.敲除β2m基因后的B16-F10細胞為可移植腫瘤奠定了基礎

適應性免疫系統(tǒng)的T淋巴細胞（T細胞）識別來自內源性細胞蛋白或細胞表面MHC I和MHC II分子呈現(xiàn)的外源性抗原的短肽。由于穩(wěn)定MHC I/肽復合物的形成嚴重依賴于與β2m（輕鏈）的結合，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除小鼠腫瘤細胞系中的β2m基因，β2m表達缺陷將導致其表面MHC分子表達不足。Das等人利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除小鼠腫瘤細胞系中的β2m基因，同時通過靶向該細胞系中的IAbβ鏈編碼位點來產(chǎn)生MHC II陰性的B16-F10細胞。研究結果表明，通過CRISPR/Cas9技術產(chǎn)生的MHC I或者MHC II缺陷腫瘤細胞系可作為親本系，用于在缺乏內源性MHC分子表達的HLA轉基因小鼠株中建立MHC兼容的可移植腫瘤模型。[3]

圖 2 不同腫瘤實體的穩(wěn)定β2m-KO克隆的表型

2.缺失JAK1的B16-F10細胞對癌癥免疫治療起著至關重要的作用

癌癥免疫療法, 包括免疫檢查點抗體和嵌合抗原受體T細胞療法雖已在臨床上取得了成功，但仍有一小部分患者表現(xiàn)出耐藥性?？蒲腥藛T認為，也許存在某一潛在機制能夠有效克服這種耐藥性并對于開發(fā)更有效的癌癥治療方法至關重要。Han等人通過CRISPR/Cas9技術建立了全基因組敲除B16-F10細胞系，通過體內過繼性OT-I T細胞轉移和體外OT-I T細胞殺傷試驗，確定Janus激酶JAK1缺陷能夠介導T細胞耐藥性：JAK1的缺失減少了B16-F10細胞中JAK信號轉導子和轉錄信號激活子，導致腫瘤對T細胞效應分子干擾素產(chǎn)生抵抗，并通過損害抗原呈遞抑制T細胞活化。這些發(fā)現(xiàn)為探索腫瘤免疫治療耐藥性提供了一種新方法，并證明了JAK1是有效治療黑色素瘤的潛在治療靶點[4]。

3.點突變后的B16-F10細胞可以精準模擬人類病理

大多數(shù)人類遺傳疾病源于 G:C>A:T 或 T:A>C:G 堿基變化的點突變，它們代表了近一半的致病性單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。人類遺傳疾病的動物模型在剖析致病機制、藥物篩選和藥效測試方面具有重要意義，而利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對B16-F10細胞進行基因敲除、點突變等基因編輯實驗，能夠構建可以精確模擬人類病理的人類疾病模型。

目前源井生物已成功利用獨家CRISPR技術——CRISPR-UTM對B16-F10細胞進行了基因編輯，并且我們還成功構建了B16-F10-Luc細胞，能夠用于活體成像等實驗，如果您需要我們的幫助，歡迎?在線咨詢我們！源井生物，讓基因編輯更簡單！

參考文獻

[1]Gerber SA, Sorensen EW, Sedlacek AL, et al. Local expression of interleukin-2 by B16 melanoma cells results in decreased tumour growth and long-term tumour dormancy [J]. Immunology, 2013, 138(3):280-292.

[2]Ercolano, Giuseppe, et al. "Knockdown of PTGS2 by CRISPR/CAS9 system designates a new potential gene target for melanoma treatment."?Frontiers in pharmacology?10 (2019): 1456.

[3]Das, Krishna, et al. "Generation of murine tumor cell lines deficient in MHC molecule surface expression using the CRISPR/Cas9 system."?PloS one?12.3 (2017): e0174077.

[4]Han, Ping, et al. "Genome-wide CRISPR screening identifies JAK1 deficiency as a mechanism of T-cell resistance."?Frontiers in immunology?10 (2019): 251.

[5]Zheng, Yaowu, et al. "Efficient Single Base Editing in Mouse Using Cytosine Base Editor 4."?Authorea Preprints?(2019).