蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。眾所周知，合理的樣本收集是關(guān)系到蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的第一步，合格的樣本質(zhì)量是獲得優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)的前提條件。那么蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)該如何處理樣本呢？小編在此匯總多年的樣本前處理經(jīng)驗(yàn)，為大家送上蛋白質(zhì)組檢測送樣指南干貨，包教包會哦！

樣本收集原則

• 一致性：除變量外，每組樣本在取材部位、時間及處理?xiàng)l件等方面盡可能保持一致。

• 代表性：正確識別并分離關(guān)注部位，避免雜質(zhì)污染。

• 迅速性：在樣本采集、制備、凍存的過程中簡化不必要的步驟，盡可能做到迅速。

• 全程低溫：樣本離體后，如有分離步驟在4℃或冰上進(jìn)行，分離好的樣本立即置于液氮中速凍，-80℃保存，避免反復(fù)凍融；膠點(diǎn)、膠條4℃保存。

• 樣本足量：應(yīng)檢測要求、生物信息學(xué)分析要求及項(xiàng)目結(jié)果準(zhǔn)確性等，各個類型樣本的送樣量及生物學(xué)重復(fù)最好大于其對應(yīng)的建議量。

• 干冰運(yùn)輸：動物樣本、植物樣本、細(xì)胞、微生物、體液、蛋白溶液等均需干冰運(yùn)輸；膠點(diǎn)、膠條、石蠟切片等需冰袋寄送。

送樣量建議

*若您的樣本不在上述列表內(nèi)可與小編聯(lián)系哦！

不同類型樣本收集流程

(一）動物組織

主要為腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚等。

1、準(zhǔn)確切除所需組織后，迅速剔除脂肪和筋皮等結(jié)締組織，預(yù)冷PBS洗滌去除殘留血液和污染物，使用干凈濾紙吸干多余水分；

2、用組織剪或手術(shù)刀將組織分離成1 cm3左右的小塊；

3、液氮速凍處理15min；

4、置于事先準(zhǔn)備好的鋁箔或無菌凍存管中，保存在-80℃，足量干冰寄送。

注意事項(xiàng)：

1、在樣本收集過程中，避免反復(fù)凍融。

2、對于類似斑馬魚大腦、小鼠海馬組織等單個實(shí)驗(yàn)動物組重量極少的情況，可根據(jù)課題需求，將多份樣本混合為一個樣品。

3、對于珍貴樣本，建議進(jìn)行樣本備份。

（二）植物組織

主要為葉片、花、根、果實(shí)、種子、藻類等。

1、收集待研究組織部位，去除附著的其他組織；

2、收預(yù)冷PBS沖洗表面附著泥土或明顯污染物，吸水紙吸去表面液體；

3、液氮速凍處理15min；

4、置于事先準(zhǔn)備好的鋁箔或無菌凍存管中，保存在-80℃，足量干冰寄送。

注意事項(xiàng)：

1、采集葉片樣本時，最好在中午光照好的時間收集。

2、對多汁的果實(shí)進(jìn)行取樣時，為保持均一性（如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比），建議將整個果實(shí)進(jìn)行研磨、凍干，粉末稱重后分裝。

3、根部、果實(shí)和種子推薦保存至離心管中，而不是錫箔紙包裹。

（三）體液

1、血清

1）使用紅色采血管采集全血，室溫靜置兩小時（避免劇烈晃動以免發(fā)生溶血）；

2）2000-3000 g離心10 min，取上層淡黃色血清樣品置于EP管中；

3）200 uL每管分裝血清樣本；

4）液氮速凍，保存在-80℃，足量干冰寄送。

2、血漿

1）使用紫色采血管（EDTA抗凝劑）采集全血，輕輕顛倒5-10次混勻，靜置30 min（避免劇烈晃動以免發(fā)生溶血）；

2）1300-2000 g離心10 min，取上清；

3）200 uL每管分裝血清樣本；

4）液氮速凍，保存在-80℃，足量干冰寄送。

注意事項(xiàng)：血清/血漿樣本收集過程中，血液摻雜異物、劇烈震蕩、離心轉(zhuǎn)速過快等均可能導(dǎo)致溶血，因此一定要嚴(yán)格控制、避免溶血；選擇抗凝劑時，推薦EDTA作為血漿抗凝劑。

3、唾液

1）采樣前先使用清水漱口；

2）取500 uL新鮮唾液于1.5 mL無菌EP管中；

3）5000 g 4°C?離心10 min，取上清；

4）液氮速凍，保存在-80℃，足量干冰寄送。

4、尿液

1）將晨起中段尿（臨床）或晨間1 h尿（動物）直接分裝到離心管中，每管1 mL；

2）5000 g 4°C?離心10 min，取上清；

3）液氮速凍，-80℃保存，足量干冰寄送。

注意事項(xiàng)：動物1 h尿量不夠，可分多次收集，如果需要收取24 h尿液，請使用帶有低溫裝置的代謝籠收??；尿液放置在室溫條件（4℃）不超過8 h。

（四）細(xì)胞

1、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1）采集適量細(xì)胞懸濁液于15 mL無菌離心管中；

2）400-1000 g離心10 min收獲細(xì)胞，去上清；

3）置于冰上，用預(yù)冷的PBS小心洗滌2次，400-1000 g離心10 min，去上清；

4）保留離心管底部細(xì)胞樣本，液氮速凍5 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

2、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1）棄掉培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿倒置于吸水紙上吸干剩余培養(yǎng)液；

2）加入預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去PBS，重復(fù)以上操作兩次以洗去培養(yǎng)液；

3）將培養(yǎng)皿置于冰上，并向培養(yǎng)皿內(nèi)加入預(yù)冷的PBS；

4）用干凈的細(xì)胞刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一側(cè)（動作要快），冰上斜置培養(yǎng)皿，使得緩沖液流向一側(cè)；

5）移液管吸取溶解產(chǎn)物至預(yù)冷的離心管內(nèi)，400-1000 g離心10 min，去上清；

3、亞細(xì)胞器

亞細(xì)胞器類樣品需要自行抽提，且抽提后建議自行定量。亞細(xì)胞器主要涵蓋葉綠體、線粒體、細(xì)胞膜、細(xì)胞核以及囊泡等，可以分別采用合適的方法（密度梯度離心、試劑盒等）將亞細(xì)胞器分離后提取蛋白，-80℃冰箱保存。

（五）微生物

1、采集適量菌液于無菌離心管中；

2、3000-5000 g離心5-15 min，去上清；

3、預(yù)冷PBS洗滌菌體沉淀3次，3000-5000 g離心5-15 min，去上清；

4、液氮速凍，保存在-80℃。

（六）其他

1、石蠟切片（FFPE）

按照石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片操作，切片規(guī)格5-10 μm厚，50 mm2大小；每個樣本包含20片以上切片，4℃保存，足量冰袋郵寄。

2、外泌體

需要自行抽提外泌體后自行進(jìn)行WB，NTA等指標(biāo)檢測，并建議測定樣本蛋白濃度，盡量保證蛋白量大于100 ug蛋白/樣，樣本-80℃保存，足量干冰寄送。

3、細(xì)胞上清

需使用無血清培養(yǎng)基；收集上清，1000-2000 g離心10 min，取上清；按上述條件再次離心取上清；-80℃凍存，足量干冰寄送。

4、其他硬質(zhì)樣本（如硬骨、牙齒等）

采集硬質(zhì)樣本，使用凍干機(jī)對樣本進(jìn)行脫水凍干；使用研磨儀將硬質(zhì)樣本研磨成均質(zhì)粉末；液氮速凍，-80℃凍存，足量干冰寄送。

5、IP/Pull down樣品

1）非變性洗脫：酸洗脫或者競爭洗脫。洗脫條件溫和，一般只會洗脫抗原和與之發(fā)生結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

2）變性洗脫：在洗干凈的protein A/G-beads中加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min；進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳，切取目標(biāo)條帶，4℃保存。采用SDT裂解液替換2×SDS上樣緩沖液，可進(jìn)行溶液樣品的質(zhì)譜鑒定工作，具體操作為：在洗干凈的protein A/G-bead中加入SDT裂解液，沸水煮10min，離心取上清，-80℃保存。

注意事項(xiàng)：采用酸洗脫方式時，若wash buffer中含有去垢劑，在elution之前務(wù)必用不含去垢劑的wash buffer洗兩遍，然后再做elution。

6、膠點(diǎn)/膠條

膠條或膠點(diǎn)等膠樣本，要求考染或銀染后條帶肉眼可見，4℃保存，冰袋郵寄。

注意事項(xiàng)：銀染樣本要求試劑質(zhì)譜兼容，且須在電泳后一周內(nèi)切膠送樣；務(wù)必冰袋郵寄，干冰會使得膠變脆，碎裂，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

通用要求

1、樣本保存：樣本盡可能采用1.5 mL或者2 mL離心管（進(jìn)口離心管）保存，運(yùn)輸時采用封口膜密封離心管，并在離心管上標(biāo)記清楚樣本名稱，按順序整齊排列在凍存盒中。不方便存儲在離心管中的體積較大的組織樣本，推薦采用錫箔紙等材料仔細(xì)包裝，標(biāo)記清楚樣本名稱，按照組別整理整齊，放置在密封袋中。避免使用易碎的容器裝載樣本。

2、樣本標(biāo)記：樣本名稱使用字母和數(shù)字，建議雙重標(biāo)記，即：使用高品質(zhì)油性筆在樣本管上清晰地標(biāo)記好樣本名稱，并用封口膜封口；將樣本名稱寫在標(biāo)簽紙上，貼在管壁，再用透明膠帶纏繞一圈，防止浸濕脫落。樣本管和送樣單不符則以實(shí)際樣本管為準(zhǔn)。

3、樣本寄送：郵寄新鮮組織或者細(xì)胞樣本時，推薦采用雙層泡沫盒密封包裝，盒中加入足量的干冰。所有樣本建議您做好備份，防止寄送過程出現(xiàn)異常導(dǎo)致樣本損壞。

常見問題

1、蛋白組學(xué)要求組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)為多少？

動、植物樣本建議每組5個，最少3個生物學(xué)重復(fù)；臨床樣本建議每組30個，最少10個生物學(xué)重復(fù)；細(xì)胞及微生物樣本建議每組不少于3個。生物重復(fù)數(shù)的不足，不構(gòu)成檢測的技術(shù)障礙，主要是會影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性，一定數(shù)量的樣本才能代表總體。

2、不同樣本類型是否可以同批次上機(jī)做的蛋白組學(xué)？

針對于Label free和DIA而言，樣本是單獨(dú)上機(jī)，不同樣本之間互不影響，可以同批次上機(jī)。針對于iTRAQ/TMT而言，由于質(zhì)譜信號噪音的存在，以及iTRAQ/TMT算法及其后期歸一化的校正過程，會導(dǎo)致即使某些樣本中不表達(dá)某個蛋白，即實(shí)際沒有肽段被對應(yīng)的標(biāo)簽標(biāo)記上，該蛋白也會被賦予一定的定量值，造成“誤解”。因此，iTRAQ/TMT不僅不適合分析不同物種（即使親緣較近）的差異比較，也不適用于分析相同物種不同部位的差異比較。

以上就是對蛋白組學(xué)研究常見樣本收集的簡單介紹啦，若您對蛋白組學(xué)送樣方面還有疑惑，可以聯(lián)系小編哦！歡迎各位老師來咨詢奧維森質(zhì)譜檢測服務(wù)！