在上一系列的干貨分享中，我們介紹了組織（細胞）特異性基因表達調(diào)控相關知識。接下來，我們將目光聚焦 “檢測工具的核心成員”——熒光素酶，開啟一個新的篇章。本系列將由熒光素酶的歷史和發(fā)展開始，詳細介紹當前熒光素酶相關實驗的干貨知識。

熒光素酶(Luciferase)

熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠催化生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，熒光素酶催化的發(fā)光也是自然界最常見的生物發(fā)光形式之一，人類對熒光素和熒光素酶觀察和研究有著悠久的歷史。伴隨著人類文明的發(fā)展，對發(fā)光生物認識也從簡單的觀察記錄轉(zhuǎn)為實驗性的探索利用。

公元前4世紀的先哲亞里士多德最早提及生物發(fā)光，17世紀羅伯特.波義耳則證明了生物發(fā)光需要氧氣的參與。19世紀 Rapha?l Dubois通過實驗發(fā)現(xiàn)了催化生物發(fā)光的重要物質(zhì)——熒光素酶和它的底物——熒光素。

隨著時間的推移，研究人員揭示了更多熒光素酶催化-熒光素發(fā)光反應背后的機制。也開始利用這個機制用于科研。

熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素的氧化過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)，可通過熒光測定設備測定反應中釋放的生物熒光。

目前，以北美螢火蟲（Photinus pyralis）來源的熒光素酶（Fluc）應用的最為廣泛，應用于分子生物學和生物分析系統(tǒng)，F(xiàn)luc具有信號強，背景干擾弱，蛋白穩(wěn)定耐熱性強，無需表達后修飾等特點，此外，其底物也無毒且十分穩(wěn)定，非常適用于體內(nèi)或者體外實驗。

Fluc是腺苷酸形成酶(adenylate-forming enzymes)超家族的一員，其利用ATP的化學能催化熒光素發(fā)生氧化、脫羧反應，并伴有發(fā)光的現(xiàn)象。Fluc會選擇含有羥基-苯并噻唑-噻唑-羧酸結(jié)構(gòu)（hydroxy- benzothiazolyl- thiazoline-carboxylic acid structure ，D-LH2）的底物，并在ATP、氧氣和金屬離子（如Mg+2）的參與下，D-LH2噻唑啉環(huán)上的羧酸鹽攻擊ATP的α-磷酸基，發(fā)生SN2親核位移反應，生成一種不穩(wěn)定的熒光素二氧乙酮（luciferin dioxetanone），隨后分解生成二氧化碳和一個處在電子激發(fā)態(tài)的氧化熒光素酶，當電子衰減到基態(tài)附近時，釋放紅色和綠色的光子，光譜的可見區(qū)在540 - 600nm之間。

除此之外，F(xiàn)luc還能催化一些脂肪酸輔酶A形成，甚至有研究通過點突變一種甲蟲的脂肪酸酶CoA合成酶，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馑孛福@些證據(jù)足以說明Fluc起源于脂肪酸CoA合成酶。

Fluc也是腺苷酸形成酶超家族中第一個通過X光進行結(jié)構(gòu)分析的成員。Fluc的C端和N端的結(jié)構(gòu)域均含有柔性鉸鏈的α+β結(jié)構(gòu)（α+β structure），熒光素的催化活性位點位于近N端的柔性鉸鏈區(qū)。通過對其結(jié)構(gòu)的認識，人類對其進行改造，使其廣泛應用于不同的檢測技術中。

另外，取自海洋腔腸動物海腎（Renilla reniformis）的熒光素酶（Rluc）也是一種可以催化底物發(fā)生熒光反應的單亞基特異活性蛋白。與Fluc不同的是，他們的底物和輔因子不同，F(xiàn)luc需要氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能催化底物熒光素發(fā)光，而Rluc僅需要氧氣便可催化底物腔腸素（coelenterazine）發(fā)光。區(qū)別于Fluc產(chǎn)生的黃綠色熒光，Rluc產(chǎn)生藍色的光，波長480nm附近。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙信號報告實驗中得到廣泛的應用。

同F(xiàn)luc一樣，Rluc在完成轉(zhuǎn)錄翻譯后即具有催化活性。熒光素酶可以作為報告基因，通過檢測熒光的強度，來反映熒光素酶的表達水平，進而反映某一表達系統(tǒng)的活力水平。

熒光素酶的具體應用，主要有以下幾個方面：?

驗證miRNA與mRNA/lncRNA/circRNA的互作

將要研究的靶點序列（序列可以是mRNA上的，也可以是lncRNA/circRNA的序列）插入到報告載體中，作為熒光素酶基因的3’UTR，與miRNA共同轉(zhuǎn)染工具細胞，如果mir與靶序列互作，則熒光素酶表達量下降（檢測的熒光信號下降）。

啟動子與轉(zhuǎn)錄因子作用分析

將要研究的啟動子序列構(gòu)建到報告載體中作為熒光素酶的啟動子，同時轉(zhuǎn)染要研究的轉(zhuǎn)錄因子過表達質(zhì)粒（根據(jù)實驗需求也可以不轉(zhuǎn)染，利用細胞內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子）。如果轉(zhuǎn)錄因子與啟動子存在相互作用，則熒光素酶表達量會發(fā)生相應改變（檢測的熒光信號隨之變化）。

檢測信號通路活性

將待研究的信號通路響應元件序列構(gòu)建到報告基因載體中，相應信號通路激活/抑制后會作用于響應元件，引起熒光素酶表達水平的改變，通過檢測熒光信號的改變來反應信號通路的活性。

動物試驗指示作用

將攜帶熒光素酶的病毒遞送載體或穩(wěn)定表達熒光素酶的腫瘤細胞注射到實驗動物體內(nèi)后，在不處死動物的情況下，通過注射熒光素酶底物，通過活體成像技術可以觀察病毒感染的組織和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移情況。

接下來的幾期內(nèi)容我們將陸續(xù)對熒光素酶在科研中的應用進行深入詳細的介紹，歡迎大家繼續(xù)關注我們的內(nèi)容。