在正式開講前，為大家簡單補充一下表達系統(tǒng)，表達系統(tǒng)可分為瞬時、穩(wěn)定和誘導表達三類：

瞬時表達系統(tǒng)是指宿主細胞在導入表達載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫；瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)點是簡捷，實驗周期短。

穩(wěn)定表達系統(tǒng)是指載體進入宿主細胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對耗時耗力。

誘導表達系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導后才得以開放。采用異源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產(chǎn)量。

目前哺乳動物細胞已成為生產(chǎn)多種生物藥物的首選宿主細胞。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)可進行翻譯后修飾，表達的重組蛋白接近人源構(gòu)象，因此被大量用于治療性重組蛋白的生產(chǎn)。

優(yōu)勢特點：重組DNA易轉(zhuǎn)染，遺傳穩(wěn)定，可重復；識別并去除了內(nèi)含子；具備翻譯后修飾（磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級結(jié)構(gòu)的正確折疊）；產(chǎn)品的構(gòu)型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好；可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡單，成本低；可用于基因治療

那么接下來我就從哺乳動物細胞表達載體的主要元件、載體類型、高效表達載體的構(gòu)建、受體細胞、外源基因?qū)胧荏w細胞的方法、以及高通量篩選技術(shù)總共六個方面分別進行介紹：

一、哺乳動物細胞表達載體的主要元件

哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件：

1） 原核序列中包括：原核復制子；抗生素抗性基因；多克隆位點

2）啟動子：分為兩類

病毒來源:SV40（綠猴空泡病毒）；CMV（巨細胞病毒）；RSV（肉瘤病毒）；ADV（腺病毒）；LTR（逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列）

細胞來源:HSP（熱休克蛋白）

3）增強子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長約200bp的一段DNA,可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子。增強子通常占100-200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。

常用增強子：SV40 enhancer；CMV enhancer；RSV enhancer；LTR enhancer

4)終止信號和poly A信號：功能是使轉(zhuǎn)錄后的mRNA能有效進行切割和加上polyA尾巴也就是多聚腺苷化，poly A增加mRNA的的穩(wěn)定性

?多聚腺苷化所需的兩種序列

位于polyA下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)

位于poly A上游11-30bp處的5’ –AAUAAA

5) 選擇標記基因：胸苷激酶基因(tk)、二氫葉酸還原酶基因 (dhfr)、新霉素抗性基因(neo)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)

接下來帶大家看一個pcDNA3的質(zhì)粒載體，從圖中可以看到CMV、T7和SV40的啟動子，Amp氨芐和新霉素抗性基因，SV40 poly A信號等所必須的控制元件：

二、哺乳動物細胞表達載體類型

分為兩類：非病毒載體（質(zhì)粒）和病毒載體（腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒）等

1）非病毒載體：由真核復制信號、啟動子、轉(zhuǎn)錄單位以及質(zhì)粒片段組成，不需要包裝細胞，比如pSV系列、pCDNA3等。接下來介紹一下常用的pcDNA3.1載體。

pcDNA3.1(+) 載體可用于在多種哺乳動物細胞系中實現(xiàn)高水平、組成型表達。包含可選標記物和多克隆位點，具有以下特點：

?具備高水平表達蛋白的巨細胞病毒(CMV)增強子啟動子

? 正向 (+) 或反向 (-) 的大分子多克隆位點

? 牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列用于增強mRNA穩(wěn)定性

? 氨芐青霉素耐藥基因和pUC復制區(qū)序列用于大腸桿菌中的選擇和維持

2）病毒型載體

病毒型載體的類型：分為兩類，即整合型和游離型

整合型：整合入宿主染色體隨染色體復制而復制，可持續(xù)表達外源基因；安全性低，可能會整合到基因編碼區(qū)導致插入誘變。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體

游離型：不整合、生物安全性高、瞬時表達。如：腺病毒載體

接下來介紹幾個常用的病毒型載體：

a. 腺病毒載體

Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對稱型，核心外層的殼體由252個殼粒亞單位組成。不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，與其致瘤性能強弱有關(guān)

下圖為腺病毒的基因結(jié)構(gòu)：

腺病毒基因組為雙鏈DNA，約長36kb,Ad2基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)有6個獨立的區(qū)域:IA(EIA)、EIB、 E2(E2A和E2B)、 E3、E4； EIA和EIB 與Ad2的啟動和轉(zhuǎn)化細胞密切有關(guān)； L1:晚期轉(zhuǎn)錄單位—結(jié)構(gòu)蛋白； Ф：包裝信號

腺病毒載體系統(tǒng)

腺病毒系統(tǒng)去除早期基因E1，將目的基因重組插入到E1基因的位置上，使其只有在提供E1基因產(chǎn)物的HEK293包裝細胞中才能進行繁殖。常用腺病毒載體+HEK293細胞來生產(chǎn)重組蛋白。腺病毒載體系由腺病毒載體、腺病毒基因組質(zhì)粒和包裝細胞組成。通過穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進包裝細胞產(chǎn)生攜帶外源基因的腺病毒。下面介紹一個常用的腺病毒系統(tǒng)：

AdMax腺病毒系統(tǒng):通過Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體。在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入loxP位點,然后將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞。通過Cre介導兩個loxP位點之間的DNA發(fā)生重組,可獲得重組腺病毒,這種重組效率比一般的細胞內(nèi)同源重組效率高。

腺病毒載體優(yōu)點:安全性高，滴度高，容量大( 36kb)，可感染非分化細胞，可直接體內(nèi)應(yīng)用，原位感染組織；是目前基因治療的最常用載體

缺點:免疫原性高，表達時間短；無組織特異性；真核細胞內(nèi)篩選復雜，費時

b. 腺相關(guān)病毒載體(AAV)

腺相關(guān)病毒:線狀單鏈DNA病毒, 缺陷型非病原性人類細小病毒，與人類疾病無關(guān)

腺相關(guān)病毒載體的優(yōu)點：感染細胞范圍廣，可感染分裂期與分裂后期細胞；野生型病毒可定點整合；90%以附加形式存在，10%整合；免疫原性弱，可反復感染

缺點：外源基因插入容量小，<=4.7kb；缺少高效的包裝細胞，制備過程復雜；隨機整合，制備滴度低，存在一定的免疫反應(yīng)。

c. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA動物病毒;基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，病毒顆粒內(nèi)部含有tRNA引物分子、反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和整合酶等組分；病毒可分為兩類:泡沫病毒類群:（如人泡沫病毒(HFV)）和慢病毒類群:（HIV Ⅰ和Ⅱ型致癌病毒類群）

上圖是逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)：ssRNA (9.2kb)

LTR ( long terminal repeat):長末端重復序列，含啟動子(5')和polyA (3)信號

Φ：包裝信號

結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白(Gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)和衣殼蛋白(env)

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)：

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)由逆轉(zhuǎn)錄表達載體、包裝細胞系和輔助包膜質(zhì)粒組成。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如pLNHX等，缺失大部分病毒序列 Gag、Pol、Env，主要包括病毒整合的長末端重復序列（LTR，含啟動子、增強子、整合必須序列）、包裝信號，以及 MCS、IRES、Puro、GFP等載體特異元件。

主要包裝細胞系整合有病毒結(jié)構(gòu)基因：Gag（編碼病毒的核心蛋白）、Pol（逆轉(zhuǎn)錄酶）、Env（病毒顆粒表面的被膜糖蛋白）等。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點：

●宿主范圍廣泛，具有強啟動子，感染效率高，被感染或轉(zhuǎn)化的細胞可以持續(xù)傳代

●不能整合非分裂細胞，只能包裝10Kb以下的外源基因，載體與內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列發(fā)生重組產(chǎn)生有復制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及病毒隨機整合而產(chǎn)生致癌的可能性

d. 慢病毒載體

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，RNA病毒；現(xiàn)有常用的慢病毒載體主要由貓免疫缺陷病毒（FIV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）慢病毒改造而來．目前慢病毒載體系統(tǒng)一般為四質(zhì)粒表達系統(tǒng)，分別為兩個包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和慢病毒表達質(zhì)粒。

慢病毒載體在應(yīng)用上具有嚴格的宿主范圍，滴度低及HIV-1獨特的致病性，限制了它作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用；現(xiàn)在其主要應(yīng)用于較難轉(zhuǎn)染的細胞。如，原代細胞、干細胞、未分化的細胞、神經(jīng)元細胞，效果好于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

優(yōu)點:不僅對分裂期細胞有感染能力，對非分裂期細胞也有感染能力；宿主范圍廣；較大容量(7~8kb)；以轉(zhuǎn)染方式主動感染宿主細胞，整合入基因組中以長期穩(wěn)定存在。

缺點:僅整合到處于增殖狀態(tài)的細胞;隨機整合插入有誘變危險；組織或細胞選擇性不高

三、高效表達載體的構(gòu)建

構(gòu)建高效表達載體被認為是提高重組蛋白表達水平的主要手段。載體構(gòu)建策略常以提高重組蛋白表達水平，增加工程細胞穩(wěn)定性為主要目標，例如:引入共

擴增基因、采用不同的表達調(diào)控元件組合、弱化篩選標記、改變基因排列方式等

1、基因擴增系統(tǒng)

二氫葉酸還原酶( dihydrofolate reductase，dhfr)系統(tǒng)：該系統(tǒng)是將目的基因和 dhfr 基因同時或分別轉(zhuǎn)染 dhfr-細胞，然后加入氨甲喋呤( methotrexate，MTX) 加壓擴增，最終目的基因得到大量擴增。

谷氨酰胺合成酶( glutamine synthetase，GS) 系統(tǒng)：GS 系統(tǒng)廣泛用于 GS內(nèi)源性表達水平很低的 NS0 和 CHO 細胞，尤其是 NS0細胞; 細胞轉(zhuǎn)染 GS 及目的基因后，使用無谷氨酰胺培養(yǎng)基，并加入蛋氨酸亞氨基代砜(MSX) 加壓篩選，使目的基因大量擴增。

2、篩選標記弱化

當外源基因整合到基因組高效轉(zhuǎn)錄位點，基因擴增的細胞通常具有更高的重組蛋白表達水平。增加篩選藥物的濃度可提高篩選強度，但藥物濃度過高常伴隨著細胞生長速率降低。弱化篩選標記可有效解決這個問題。

弱化篩選標記的策略有兩種:

第1種策略是突變篩選標記降低其活性。

第2種策略是降低篩選標記的表達，采用弱啟動子起始篩選標記的轉(zhuǎn)錄最常見。

3、克服位置效應(yīng)

目前，目的基因整合進入宿主細胞基因組常采用隨機整合。該方法導致外源基因插入染色體的位置、拷貝數(shù)、表達水平等情況都不可預知。染色體上外源基因插入?yún)^(qū)域的狀態(tài)會影響其表達，即所謂的位置效應(yīng)( position effect) 。

克服位置效應(yīng)目前主要有兩種策略：

第1種策略是在外源基因兩端引入某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

第2種策略是利用同源重組使外源基因定點整合進入轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，提高目的基因轉(zhuǎn)錄水平。

四、哺乳動物表達系統(tǒng)受體細胞

用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動物細胞包括人胚胎腎細胞HEK293、人胚胎視網(wǎng)膜細胞PER.C6、MDCK細胞、非洲綠猴腎細胞COS、小鼠骨髓瘤細胞NS0和Sp2 /0、倉鼠腎細胞 BHK-21 以及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)等。

HEK293細胞多用于瞬時轉(zhuǎn)染表達重組蛋白，NS0 和 Sp2/0 用于鼠源單克隆抗體生產(chǎn)。下面重點介紹四種受體細胞

（1）CHO細胞系：

CHO細胞系是哺乳動物蛋白質(zhì)生產(chǎn)的主要細胞，適應(yīng)性強，可在懸浮培養(yǎng)基中高密度生長，并易于適應(yīng)無血清條件，但其克隆穩(wěn)定性差。

CHO細胞具有不同的譜系：CHO-K1，CHO-S，CHO-DG44和CHO-DXB11，為了提高重組蛋白的產(chǎn)率，研究者們會對CHO進行抗凋亡以及糖工程的改造。

（2）HEK293細胞系：

HEK293細胞，又叫人胚胎腎細胞293，是一個衍生自人胚胎腎細胞的細胞系，具有轉(zhuǎn)染效率高，易于培養(yǎng)等特點；293細胞的一個衍生株：293T/17的轉(zhuǎn)染效率更高；293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結(jié)果

（3）PER.C6細胞系：

PER.C6（Crucell）系最初是用腺病毒載體的E1小基因轉(zhuǎn)染無限增殖的人視網(wǎng)膜母細胞產(chǎn)生的，可以在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)至高細胞密度（最高1×107細胞/ml）。據(jù)報道，這些細胞在沒有任何培養(yǎng)基或飼料優(yōu)化的情況下很容易產(chǎn)生300-500 mg/L的IgG

（4）CAP/CAP-T細胞系：

CAP細胞系最初是用Ad5的E1轉(zhuǎn)化原代人羊膜細胞產(chǎn)生的。CAP-T是該系的一個變種，組成性表達SV40大T抗原，使它們適合作為宿主，利用攜帶SV40 ori的質(zhì)粒進行瞬時基因表達；該細胞系能夠表達和分泌以前難以表達的蛋白質(zhì)。其他一些蛋白（分泌的胚胎堿性磷酸酶、SEAP和激酶受體胞外結(jié)構(gòu)域）的產(chǎn)量表明，CAP-T細胞至少與HEK 293-E細胞一樣好，甚至更好，并且優(yōu)于CHO細胞

五、外源基因?qū)胧荏w細胞的方法

將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎?主要有2類方法：

a.感染性病毒顆粒感染宿主細胞;

b.通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊毎?/p>

表中是總結(jié)的哺乳動物細胞各種異源基因轉(zhuǎn)染方法，最左側(cè)項目中“*”表示從質(zhì)粒構(gòu)建完成到異源基因轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細胞完成的時間；“￡”表示外源蛋白的表達水平；“§”表示當外源基因轉(zhuǎn)染宿主細胞時，基因必須轉(zhuǎn)移到細胞核來工作；“¤”表示適用于造血細胞；“#”表示不適用于造血細胞；“**”表示由于異源基因位于細胞質(zhì)內(nèi)游離的質(zhì)粒中，目的基因能瞬時表達

六、高通量篩選技術(shù)

由于轉(zhuǎn)染、外源基因整合、篩選等過程會對細胞造成不同程度的破壞，直接造成克隆的高度不均一性，而高產(chǎn)陽性克隆只占極少數(shù)。獲取高產(chǎn)陽性克隆的經(jīng)典方法是有限稀釋法，操作簡單，但耗時耗力。目前，高通量篩選技術(shù)技術(shù)已經(jīng)被用于細胞克隆篩選，下面介紹兩種高通量篩選技術(shù)。

1、基于熒光活化細胞分選技術(shù)(FACS) ：

FACS基本流程是熒光標記樣本細胞，激發(fā)使之產(chǎn)生特定熒光，隨后檢測熒光并分析，之后使含有目的克隆的液滴帶電并收集；FACS 不僅可以在高流速下監(jiān)測多波長，還能同時獲取細胞粒度、大小等參數(shù)。

目前，基于FACS 有幾種不同的高表達細胞株篩選策略，其主要區(qū)別在熒光標記策略，常用策略有以下：

(1) 直接在載體構(gòu)建時引入熒光蛋白基因；

(2) 凝膠微滴法:在生物素化的瓊脂糖基質(zhì)中包裹單個細胞，熒光標記的一抗結(jié)合重組蛋白，形成的復合物與固定化的二抗結(jié)合；

(3) 親和基質(zhì)吸附法:在細胞表面交聯(lián)低通透性基質(zhì)吸附細胞分泌的蛋白，熒光標記抗體識別目的蛋白并與之結(jié)合；

(4) 冷捕獲法: 采用低溫手段使正在分泌的蛋白來不及脫離細胞表面，熒光標記抗體識別并結(jié)合目的蛋白；

2、ClonePix 高效細胞克隆篩選系統(tǒng)

原理：借助熒光偶聯(lián)抗體，通過熒光成像和精密的機械設(shè)計篩選并挑取分泌表達單體蛋白的CHO細胞和HEK293細胞，最終獲得高表達目標蛋白的優(yōu)質(zhì)細胞株。

待(懸浮或貼壁)細胞在半固體培養(yǎng)基中生長成分離的克隆后，ClonePix系統(tǒng)通過熒光染料標記的特異性抗體(抗蛋白質(zhì)本身或抗蛋白標簽)對其成像。系統(tǒng)通過分析這些圖片篩選出高表達目標蛋白的細胞克隆。ClonePix系統(tǒng)具有5個熒光通道，還有白光成像用于克隆識別。至多3個熒光通道可以疊加，因此可以在單次挑取中采用多種熒光探針。

好了，這部分就介紹到這里，別忘了點贊、轉(zhuǎn)發(fā)、關(guān)注我們，下一期推文見！

圖片來源Biorender和網(wǎng)絡(luò)

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