2022年1月5日中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所在Science Translational Medicine (ISSN：IF17.956 )雜志上發(fā)表題為“TRIB3 reduces CD8+ T cell infiltration and induces immune evasion by repressing the STAT1-CXCL10 axis in colorectal cancer”的文章，探討了TRIB3促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤免疫逃逸的作用及機(jī)制，并討論了靶向TRIB3的ICB治療增敏潛能。接下來小編帶帶大家一起領(lǐng)略這篇文章的風(fēng)采。

研究背景

結(jié)直腸癌中CD8+ T細(xì)胞浸潤程度高提示預(yù)后良好，免疫治療效果滿意，然而，絕大多數(shù)CRC患者由于T細(xì)胞浸潤不良而不能從免疫治療中獲益，T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腫瘤組織的放松管制是腫瘤T細(xì)胞浸潤缺乏的原因之一。TRIB3是一種癌蛋白，多項(xiàng)研究表明TRIB3在免疫應(yīng)答中具有調(diào)節(jié)功能，但它在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用尚未明確。識(shí)別這些在結(jié)直腸癌中的免疫改變及其潛在機(jī)制，可能為改善可能受益于ICB治療的結(jié)直腸癌患者的頻率提供新的可能性。

研究過程

1、探究TRIB3是否參與腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)

2、證明糖尿病相關(guān)的TRIB3表達(dá)與CRC組織中CD8+ T細(xì)胞的排除有關(guān)

3、確定TRIB3通過STAT1-CXCL10信號通路抑制T細(xì)胞浸潤

4、探究糖尿病中的高糖狀態(tài)是如何誘導(dǎo)TRIB3表達(dá)

5、研究互作蛋白乙?；绾巫鳛門RIB3穩(wěn)定信號（相互作用蛋白-質(zhì)譜鑒定-青蓮百奧提供技術(shù)支持）

6、確證TRIB3-K240乙?；閷?dǎo)CRC中高糖誘導(dǎo)的免疫逃逸

1、探究TRIB3是否參與腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)

首先構(gòu)建MC38細(xì)胞皮下接種免疫缺陷BALB/c-nude小鼠或免疫正常C57BL/6J小鼠并敲除TRIB3，發(fā)現(xiàn)敲除TRIB3可降低MC38腫瘤的生長。MC38細(xì)胞中TRIB3的缺失導(dǎo)致約50%的腫瘤抑制率，表明TRIB3在抗腫瘤免疫應(yīng)答調(diào)控中的潛在作用。MC38細(xì)胞中TRIB3的敲除增加了腫瘤CD8+ T細(xì)胞浸潤，過度的TRIB3?MC38細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的生長和抑制CD8 + T細(xì)胞浸潤和功能。研究結(jié)直腸癌小鼠模型的組織切片，TRIB3的下調(diào)增強(qiáng)了結(jié)直腸癌組織中CD8+ T細(xì)胞的浸潤，相比之下，TRIB3的異位表達(dá)抑制了浸潤。同時(shí)CRC患者的腫瘤組織芯片證實(shí)TRIB3蛋白表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)?？偠灾?，TRIB3的高表達(dá)會(huì)損害CRC組織中CD8+ T細(xì)胞的浸潤。

2、證明糖尿病相關(guān)的TRIB3表達(dá)與CRC組織中CD8+ T細(xì)胞的排除有關(guān)

糖尿病與早發(fā)性CRC風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，因此作者發(fā)現(xiàn)糖尿病CRC腫瘤組織中TRIB3在高度表達(dá)，糖尿病和CRC患者的腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞浸潤與非糖尿病患者相比減少，且TRIB3的表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞浸潤C(jī)RC組織呈負(fù)相關(guān)。與糖尿病小鼠相比，非糖尿病小鼠中有更多的CD8+ T細(xì)胞浸潤MC38細(xì)胞來源的腫瘤組織。將對照組或TRIB3缺陷的MC38細(xì)胞接種到糖尿病小鼠，評估TRIB3與糖尿病腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞的排除有關(guān)。對腸道上皮特異性TRIB3缺陷老鼠(TRIB3IEC-KO)建立CRC糖尿病條件下小鼠模型，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特異性TRIB3的缺失減緩了自發(fā)CRC進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明，糖尿病相關(guān)的TRIB3表達(dá)阻礙了CD8+ T細(xì)胞向CRC組織的浸潤。

3、確定TRIB3通過STAT1-CXCL10信號通路抑制T細(xì)胞浸潤

趨化因子是影響CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腫瘤部位的主要因素，探究了了TRIB3是否通過影響趨化因子的表達(dá)來減少T細(xì)胞的腫瘤浸潤。研究表明敲除TRIB3可上調(diào)CXCL10的表達(dá)，ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)在正?；蚋咛翘幚?xiàng)l件下，敲除TRIB3會(huì)增加CXCL10蛋白的表達(dá)，高糖條件下CXCL10蛋白的減少由于TRIB3缺失而被逆轉(zhuǎn)，過表達(dá)TRIB3抑制了CXCL10蛋白的表達(dá)，阻斷CXCL10逆轉(zhuǎn)了TRIB3誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞在人原代CRC-30和小鼠MC38細(xì)胞中的遷移。

STAT1為介導(dǎo)CXCL10轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，參與了TRIB3調(diào)控的CXCL10轉(zhuǎn)錄。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，在MC38細(xì)胞中，TRIB3過表達(dá)會(huì)下調(diào)STAT1活性，TRIB3缺失促進(jìn)了STAT1的轉(zhuǎn)錄，但沒有改變其蛋白的穩(wěn)定性。緊接著建立了CXCL10過表達(dá)的MC38衍生腫瘤模型確定TRIB3是否通過調(diào)節(jié)CXCL10在體內(nèi)損害CD8+ T細(xì)胞浸潤。CXCL10的異位表達(dá)抑制了TRIB3過表達(dá)的原生效應(yīng)，消除了TRIB3對CD8+ T細(xì)胞浸潤的抑制作用，表明TRIB3在一定程度上通過抑制CXCL10介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞招募來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。使用糖尿病CXCL10基因敲除(CXCL10KD)的mc38衍生腫瘤模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。

4、P300誘導(dǎo)TRIB3乙?；?，增強(qiáng)了TRIB3蛋白的穩(wěn)定性

糖尿病中的高糖狀態(tài)是如何誘導(dǎo)TRIB3表達(dá)的？研究發(fā)現(xiàn)高糖處理對TRIB3的轉(zhuǎn)錄沒有影響，但增強(qiáng)了外源轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中TRIB3的蛋白表達(dá)。在HCT-8細(xì)胞中高糖處理也延長了TRIB3的半衰期，表明高糖通過增強(qiáng)TRIB3蛋白的穩(wěn)定性促進(jìn)了TRIB3的高表達(dá)。

高葡萄糖導(dǎo)致乙酰輔酶CoA的產(chǎn)生，也是蛋白質(zhì)乙酰化修飾所需的乙酰基的唯一供體。因此，研究了高糖是否誘導(dǎo)了TRIB3的乙?；淖?。高糖處理以時(shí)間依賴的方式刺激HCT-8、DLD-1和HT-29細(xì)胞中的TRIB3乙?；胹iRNA介導(dǎo)的功能缺失策略篩選了經(jīng)典的乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60、P300、CBP。后續(xù)發(fā)現(xiàn)P300敲除或C646處理降低了4T1細(xì)胞中TRIB3的表達(dá)，在CRC患者的組織中，腫瘤組織樣本中的P300高于相鄰的非腫瘤組織樣本。這些結(jié)果表明P300誘導(dǎo)了CRC中TRIB3的乙?；⒃鰪?qiáng)了TRIB3蛋白的穩(wěn)定性。GST免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRIB3和P300之間的直接相互作用。隨后作者將TRIB3?KDC結(jié)構(gòu)域的所有賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼?R)殘基，確定K240是P300對TRIB3的乙?；稽c(diǎn)，表明p300介導(dǎo)的K240乙酰化作用是維持TRIB3穩(wěn)定性的信號。

5、TRIB3的乙?；魅趿似渑cSIAH1 E3連接酶的相互作用接下來研究了p300介導(dǎo)的K240乙?；绾巫鳛門RIB3穩(wěn)定信號，過表達(dá)P300抑制了野生型突變體泛素化，但對TRIB3-K240R沒有抑制。通過免疫沉淀和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)CHIP蛋白TRIM38和C末端被鑒定為TRIB3的結(jié)合部位。P300的影響與四個(gè)TRIB3?E3連接之間的相互作用，尤其P300的交互抑制TRIB3?SIAH1。此外，當(dāng)SIAH1基因缺失時(shí)，P300并沒有增強(qiáng)TRIB3的穩(wěn)定性?？傊@些數(shù)據(jù)表明p300催化的TRIB3的K240乙?；柚沽薙IAH1結(jié)合和TRIB3泛素化降解。

6、TRIB3-K240乙?；閷?dǎo)CRC中高糖誘導(dǎo)的免疫逃逸

為了確定TRIB3?K240乙酰化在CRC免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，研究人員構(gòu)建了K240乙酰化抗性MC38和HCT-8細(xì)胞(TRIB3KD/K240ROE，以下簡稱TRIB3Ace-Resis)。TRIB3Ace-Resis細(xì)胞表現(xiàn)出更高的CXCL10表達(dá)。TRIB3Ace-Resis組TRIB3降低,增加pSTAT1和STAT1表達(dá)，CXCL10的轉(zhuǎn)錄趨勢與STAT1相同。這些數(shù)據(jù)表明，P300在K240位點(diǎn)對TRIB3進(jìn)行乙?；揎棧ㄟ^TRIB3-STAT1 - CXCL10軸，在非糖尿病和糖尿病性結(jié)直腸癌情況下，都是一種關(guān)鍵的分子機(jī)制。

7.靶向TRIB3乙酰化使腫瘤對ICB治療敏感

為了探索靶向TRIB3乙?；隗w內(nèi)腫瘤免疫和免疫治療中的潛力，使用C646在患有CT26原位CRC腫瘤的糖尿病小鼠中藥理抑制TRIB3乙?；嗡幹委煱l(fā)現(xiàn)部分減緩腫瘤進(jìn)展，聯(lián)合抗體抗腫瘤效果增強(qiáng)，增加了CD8+ T細(xì)胞浸潤，并增加了腫瘤微環(huán)境中IFN-+和顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞的百分比。這些數(shù)據(jù)表明，通過藥物抑制TRIB3乙?；Y(jié)合ICB療法，通過降低TRIB3穩(wěn)定性，招募和激活腫瘤微環(huán)境中的CD8+ T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫。

小結(jié)

此項(xiàng)研究證明了TRIB3在各種CRC小鼠模型中抑制CD8+ T細(xì)胞浸潤。發(fā)現(xiàn)TRIB3被乙酰轉(zhuǎn)移酶P300乙?；?，抑制了TRIB3的泛素化和隨后的蛋白酶體降解。異位表達(dá)的TRIB3通過增強(qiáng)表皮生長因子受體信號通路，抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1 (STAT1)的激活和STAT1介導(dǎo)的CXCL10轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤浸潤T細(xì)胞的減少。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了TRIB3是CRCs中CD8+ T細(xì)胞浸潤的負(fù)調(diào)節(jié)因子，突出了治療免疫“冷”CRCs的潛在治療靶點(diǎn)。