糖尿病是一種在全球范圍內(nèi)迅速增長的疾病，對人類健康有重大威脅[1]。其中，2型糖尿?。═2DM）是糖尿病的主要形式，而在我國T2DM占所有糖尿病病例的90%以上。肥胖常常是T2DM的主要危險(xiǎn)因素，T2DM從代償性胰島素抵抗進(jìn)展為胰島β細(xì)胞衰竭[2]，最終導(dǎo)致無代償性的高血糖。由于胰島β細(xì)胞凋亡的具體原因及其在代償期的預(yù)防機(jī)制尚不清楚，因此，探究肥胖后β細(xì)胞凋亡和功能障礙的具體分子機(jī)制，對于我國廣大糖尿病高危人群預(yù)防肥胖引發(fā)的T2DM具有重要意義。

circRNA作為一種新型的非編碼RNA分子，參與了多種疾病的進(jìn)展過程。先前研究表明胰島中有數(shù)千種胰島特異性circRNA，也有部分研究為了解circRNA在胰島β細(xì)胞中的功能提供了重要基礎(chǔ)[3]，但目前尚不清楚這些circRNA如何導(dǎo)致肥胖介導(dǎo)的β細(xì)胞功能障礙和凋亡。circGlis3是一種富含在胰島中的circRNA，在遺傳和飲食肥胖小鼠模型的胰島中上調(diào)，而這種表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌增強(qiáng)、β細(xì)胞凋亡減輕。因此，探究circRNA在胰島中的具體機(jī)制，可以為預(yù)防糖尿病提供新思路和新策略。

2023年1月21日，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張方方副研究員團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=17.694）發(fā)表文章：Circular RNA circGlis3 protects against islet β-cell dysfunction and apoptosis in obesity。在本文中，作者發(fā)現(xiàn)了肥胖小鼠胰島和肥胖人群血清中circGlis3的異常高表達(dá)并增強(qiáng)了胰島素分泌。機(jī)制上，circGlis3通過吸收miR-124-3p上調(diào)NeuroD1和Creb1促進(jìn)胰島素分泌，并通過與促凋亡因子SCOTIN相互作用減少細(xì)胞凋亡。RNA結(jié)合蛋白FUS招募circGlis3，并共同組裝異常的細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒（SG）以響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了circRNA在β細(xì)胞補(bǔ)償中的生理作用，并表明circGlis3表達(dá)的調(diào)節(jié)可能是預(yù)防肥胖后因β細(xì)胞功能障礙和凋亡引發(fā)糖尿病的潛在策略。

1.circGlis3在肥胖雄性小鼠的胰島中表達(dá)升高

作者對三種小鼠模型進(jìn)行了circRNA表達(dá)譜分析，結(jié)合先前研究中對胰島中circRNA的檢測信息，經(jīng)過分析比較和RT-PCR驗(yàn)證，作者選擇circGlis3進(jìn)行下一步研究。作者通過對小鼠胰島中circGlis3表達(dá)的測量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)circGlis3的表達(dá)增加，肥胖小鼠的胰島和其他組織中circGlis3的表達(dá)水平也均有所增加。經(jīng)過一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)糖耐量在肥胖飲食和遺傳小鼠模型中，患有糖耐量受損（IGT）或T2DM的個(gè)體中，他們體內(nèi)circGlis3的水平增加。

2.剪接因子QKI調(diào)節(jié)circGlis3的形成

作者使用Sanger測序、瓊脂糖凝膠電泳、RNase處理、RT-PCR、原位雜交等手段對circGlis3進(jìn)行基礎(chǔ)分析，證實(shí)了circGlis3存在反向剪接且為環(huán)狀并通常位于細(xì)胞質(zhì)中。作者檢測剪接因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的剪接因子QKI在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都有所增加，并且mRNA與circGlis3的表達(dá)水平呈正相關(guān)。RT-PCR分析證實(shí)了QKI異位表達(dá)對circGlis3產(chǎn)生影響。作者通過RIP、RT-PCR、RNA pull down實(shí)驗(yàn)等操作證實(shí)了QKI與Glis3基因中形成circRNA的外顯子3上下游結(jié)合，促進(jìn)circGlis3的生成。

3.?circGlis3的上調(diào)促進(jìn)胰島素轉(zhuǎn)錄并減輕體外β細(xì)胞凋亡

作者使用sh-circGlis3、sh-NC、oe-circGlis3質(zhì)粒在β細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)/敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circGlis3能夠顯著增加胰島素的表達(dá)。而在高糖環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制circGlis3的表達(dá)會(huì)減少胰島素的分泌，但不影響胰高血糖素和生長抑素的分泌。作者又檢測了多種轉(zhuǎn)錄因子的mRNA，證實(shí)了胰島素增加過程與轉(zhuǎn)錄相關(guān)。作者使用CCK8、Ki67免疫熒光染色、western blot、TUNEL分析等實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，下調(diào)circGlis3促進(jìn)cleaved-caspase3和BAX的表達(dá)、抑制BCL2的表達(dá)；上調(diào)circGlis3會(huì)抑制肥胖誘導(dǎo)的β-細(xì)胞凋亡。綜上所述，circGlis3的上調(diào)可以減輕肥胖期間的β細(xì)胞凋亡。

4.circGlis3的過表達(dá)對體內(nèi)β細(xì)胞功能障礙和凋亡的保護(hù)作用

作者通過直接向小鼠注射過表達(dá)腺病毒載體進(jìn)行后續(xù)研究。結(jié)果顯示，小鼠胰島素抵抗指數(shù)的穩(wěn)態(tài)模型評估（HOMA-IR）和胰島素原與胰島素比值顯著降低。結(jié)果還顯示，circGlis3過表達(dá)提高了葡萄糖耐量和胰島素敏感性，并增強(qiáng)了胰島素的分泌。作者分離胰島進(jìn)行后續(xù)研究，使用胰腺切片的形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)處理小鼠的β細(xì)胞質(zhì)量比對照小鼠高1.7倍。circGlis3的上調(diào)導(dǎo)致裂解的Caspase3和BAX表達(dá)顯著降低，同時(shí)增加BCL2表達(dá)。作者使用相同的方法對另一模型小鼠進(jìn)行研究，結(jié)果表明飲食和遺傳肥胖小鼠模型中circGlis3的過表達(dá)可改善β細(xì)胞功能，同時(shí)抑制β細(xì)胞凋亡，證實(shí)circGlis3對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響是β細(xì)胞介導(dǎo)的。

5.circGlis3通過吸收miR-124-3p調(diào)節(jié)胰島素轉(zhuǎn)錄

作者使用四種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行原位分析，預(yù)測了四種miRNA可能是circGlis3的靶點(diǎn)，接著在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢測上述miRNA，并通過生物素標(biāo)記、RT-PCR、RNA pull down、RNA原位雜交等手段證實(shí)了miR-124-3p覆蓋內(nèi)源性circGlis3，與circGlis3高度富集且在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共定位。作者運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和調(diào)節(jié)circGlis3的表達(dá)證實(shí)了circGlis3能作為miR-124-3p的分子海綿。作者進(jìn)行的rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-124-3p過度表達(dá)導(dǎo)致的胰島素轉(zhuǎn)錄減少部分被circGlis3過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，而其介導(dǎo)胰島素分泌抑制也能被circGLis3過表達(dá)消除。最后作者結(jié)合熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)circGlis3作為miR-124-3p的海綿，可上調(diào)NeuroD1和Creb1的表達(dá)，從而促進(jìn)胰島素的轉(zhuǎn)錄和分泌。

6.circGlis3與SCOTIN相互作用防止β細(xì)胞凋亡

作者通過使用體外轉(zhuǎn)錄和環(huán)化反應(yīng)的測定制備了生物素化circGlis3，將其pull down后進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到SCOTIN和FUS可能與circGlis3直接結(jié)合發(fā)揮RNA結(jié)合蛋白作用。SCOTIN是一種促凋亡因子，在DNA損傷或細(xì)胞壓力時(shí)以依賴于Caspase的方式被激活。作者通過RIP實(shí)驗(yàn)、生物素標(biāo)記、western blot、免疫熒光染色和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法，證實(shí)了circGlis3與SCOTIN的相互作用。rescue實(shí)驗(yàn)表明circGlis3上調(diào)能夠消除SCOTIN導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增加。作者還進(jìn)行了SCOTIN過表達(dá)的rescue實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果表明，circGlis3通過與SCOTIN相互作用并抑制Caspase3的活性，在肥胖期間以Caspase依賴的方式防止β細(xì)胞凋亡。

7.FUS隔離circGlis3以減少其在糖尿病中的豐度

FUS是一種70 kD的RNA結(jié)合蛋白，具有多種功能，可在應(yīng)激反應(yīng)中穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間。作者使用RNA pull down和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)生物素標(biāo)記的circGlis3 pulldown能夠富集到FUS，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中FUS的表達(dá)幾乎沒有增加。作者運(yùn)用RIP實(shí)驗(yàn)和western blotting，發(fā)現(xiàn)FUS直接與circGlis3結(jié)合。一系列競爭抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FUS過表達(dá)可能會(huì)逆轉(zhuǎn)circGlis3對miR-124-3p的抑制作用，還可以競爭性抑制SCOTIN對circGlis3的富集。SCOTIN過表達(dá)后，F(xiàn)US與circGis3的結(jié)合也減少。作者又對circGlis3和FUS染色，隨后又進(jìn)行可減少細(xì)胞應(yīng)激顆粒（SG）組裝的藥物emetine干預(yù)和RT-PCR，結(jié)果表明，在糖尿病的發(fā)展過程中，F(xiàn)US與miR-124-3p和SCOTIN競爭以結(jié)合circGls3，通過FUS形成的SG的募集功能限制細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)散，導(dǎo)致circGlis3的減少。

小結(jié)

這項(xiàng)研究成果表明：circGlis3在肥胖相關(guān)β細(xì)胞功能障礙的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。circGlis3的過表達(dá)上調(diào)了胰島素的轉(zhuǎn)錄和分泌，改善了異常的葡萄糖耐量和β細(xì)胞凋亡，circGlis3的增加將成為T2DM的診斷和治療靶點(diǎn)，為circRNA在糖尿病中的調(diào)節(jié)功能帶來新的思路，為預(yù)防肥胖誘因的糖尿病提供策略。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-35998-z

參考文獻(xiàn)：

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3. Stoll, L. et al. Circular RNAs as novel regulators of β-cell functions in normal and disease conditions. Mol. Metab. 9, 69–83 (2018).

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