在生物科學領域，基因沉默現(xiàn)象引起了科研人員極大的興趣?；虺聊?，顧名思義，是指通過特定手段使基因失去活性或降低其表達水平的過程。這一現(xiàn)象在生物體內(nèi)普遍存在，對于維持生命活動的穩(wěn)定以及應對各種環(huán)境變化具有重要意義。本文將詳細介紹基因沉默的概念、常用技術和實驗步驟，展望其應用前景，以期幫助讀者更好地理解這一現(xiàn)象。 ? 一、基因沉默的概念 ? 基因沉默主要指基因表達的抑制和沉默現(xiàn)象。在生物體內(nèi)，基因的表達受到嚴格調(diào)控，而基因沉默就是一種重要的基因表達調(diào)控方式。根據(jù)作用方式的不同，基因沉默可分為自然發(fā)生的基因沉默和人為操作的基因沉默。自然發(fā)生的基因沉默可通過多種因素實現(xiàn)，如DNA甲基化、異染色質(zhì)形成、轉(zhuǎn)錄后基因沉默（RNAi）等。而人為操作的基因沉默則可以通過基因敲除、轉(zhuǎn)錄因子抑制、表觀遺傳修飾等方法實現(xiàn)。 ? 二、常用基因沉默技術 ? RNA干擾（RNAi）：RNAi技術利用雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)特異性mRNA的降解，從而降低或關閉目標基因的表達。RNAi技術具有高效、特異性強、操作簡單等優(yōu)點，已成為研究基因功能和藥物篩選的重要工具。然而，該技術也存在一定的脫靶效應和細胞毒性等問題。 ? 化學沉默：化學沉默是指通過特定的化學抑制劑或藥物作用于細胞，干擾基因的表達或轉(zhuǎn)錄過程，從而實現(xiàn)基因沉默。常用的化學沉默藥物包括DNA甲基化抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑等。這類方法的優(yōu)點是可以通過口服或注射給藥，直接作用于患者體液或組織，但對于作用機制和藥物劑量要求較高。 ? 基因敲除：基因敲除技術通過同源重組或CRISPR-Cas9等手段，將目標基因進行部分或完全敲除。該技術具有較高的特異性和可操作性，但需要設計特異性的核酸酶，且存在一定的細胞毒性風險。 ? ? 三、RNA干擾（RNAi）基因沉默技術的基本步驟 ? 尋找目的基因：確定想要沉默的目標基因，可以通過文獻研究、基因表達譜分析等方法來篩選。 ? 設計并合成siRNA：根據(jù)目標基因的序列，設計并合成能與目標基因特異結(jié)合的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）。shRNA在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和表達后，會形成約21-23bp的siRNA。 ? 轉(zhuǎn)錄和表達shRNA：將設計好的shRNA通過轉(zhuǎn)染或者其他方式轉(zhuǎn)入到細胞中，并在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達shRNA。 ? siRNA與目標基因結(jié)合：轉(zhuǎn)錄后形成的siRNA在細胞內(nèi)與目標基因結(jié)合，抑制目標基因的表達。這一過程需要RNA解旋酶將siRNA雙鏈解開，反義鏈與RNA誘導沉默復合物RISC形成復合物，最終由siRNA互補結(jié)合靶RNA引導核酸酶切割，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。 ? 驗證基因沉默效果：通過qRT-PCR、Western Blot等技術檢測目標基因的表達水平，評估基因沉默效果。 ? 這些步驟是RNAi基因沉默技術的基本流程，具體操作可能因?qū)嶒炇液脱芯啃枨蠖兴煌?? PS： shRNA和siRNA在RNAi過程中具有密切關系。它們都是具有一定結(jié)構特點的RNA序列，在RNAi通路中發(fā)揮關鍵作用。 ? siRNA是RNA干擾過程中觸發(fā)基因沉默的主要分子。在RNAi通路中，siRNA通過與互補mRNA分子雜交干擾基因表達。這種干擾會導致mRNA降解，進而抑制特定基因的表達。 ? shRNA是siRNA的前體，由短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA）加工而來。shRNA的結(jié)構由互補的兩條序列及l(fā)oop環(huán)組成。在形成siRNA的過程中，shRNA會被Dicer酶切割，生成21-23bp的siRNA。然后，siRNA會裝載到RISC復合物上，并與與其序列同源的靶mRNA結(jié)合，引導RISC復合物切割靶mRNA，從而觸發(fā)基因沉默。 ? 總之，shRNA和siRNA在RNAi過程中具有密切關系，shRNA經(jīng)過加工生成siRNA，后者是觸發(fā)基因沉默的關鍵分子。 ? ? 四、基因沉默RNAi試劑推薦 ? 1.?Dharmacon可提供的siRNA產(chǎn)品類型

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1）ON-TARGETplus? siRNA——全新的基因沉默標準，顯著降低脫靶效應

基因沉默中最主要的脫靶效應是由反義鏈中“seed region”活性引起的，一味地提高反義鏈的活性可能增加由反義鏈引起的脫靶。ON-TARGETplus ?在SMARTselection技術基礎上結(jié)合最新的功能性和特異性設計原則，并利用獨—無二的雙鏈修飾技術——結(jié)合正義鏈失活技術和反義鏈seed region 修飾技術，同時減少由雙鏈引起的脫靶效應，使得ON-TARGETplus??siRNA的脫靶效應降到最低。 ?

圖注：ON-TARGETplus?修飾減少了脫靶效應，而SMARTpool進一步減少了脫靶的數(shù)量

2）siGENOME? siRNA——經(jīng)濟、可信的基因沉默工具

siGENOME?合理分析鏈偏好性，選擇合適靶點，同時選擇性使用ON-TARGET?技術保證沉默效率和低脫靶率。 ?

3）Accell? siRNA—史無前例的新武器，無需任何轉(zhuǎn)染試劑

l?極簡的操作方法：無需轉(zhuǎn)染試劑、電轉(zhuǎn)儀器或病毒載體即可完成高效siRNA投遞 l?創(chuàng)新的siRNA修飾專利方法，同時擁有高攝取率、高穩(wěn)定性、高特異性和高沉默效率 l?已在神經(jīng)細胞、免疫細胞、原代細胞等難轉(zhuǎn)染的細胞中成功應用 l?特殊的穩(wěn)定性修飾，可直接應用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染 l?低細胞毒性，可對細胞持續(xù)使用，延長靶基因的沉默持續(xù)時間

圖注：Accell? siRNA 操作步驟

1.?Dharmacon可提供的shRNA產(chǎn)品類型

1）GIPZ?慢病毒載體shRNA——模擬microRNA設計的shRNA，高效低毒，保證沉默效率

l?Dharmacon針對人和小鼠的每個基因分別設計了多條shRNA，從而保證沉默效率 l?TurboGFP報告基因和shRNA受同—啟動子啟動表達，監(jiān)測shRNA表達效果 l?可用于轉(zhuǎn)導原代細胞或非分裂細胞 l?提供甘油菌克隆及克隆set，可利用puromycin篩選穩(wěn)定細胞株

GIPZ shRNA質(zhì)粒載體元件示意圖

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