導(dǎo)讀

? 蛋白質(zhì)磷酸化修飾定義？

? 蛋白質(zhì)磷酸化修飾類別？

? 蛋白質(zhì)磷酸化鑒定方法有哪些？

? 蛋白質(zhì)磷酸化肽段富集方法？

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾，在脊椎動(dòng)物基因中，約有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸酶。它可以通過激發(fā)、調(diào)節(jié)諸多信號(hào)通路進(jìn)而參與調(diào)控生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、逆境應(yīng)激、疾病發(fā)生等多種生命過程，一直是生物學(xué)研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。

1. 蛋白質(zhì)磷酸化

蛋白磷酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的磷酸基團(tuán)（P04）轉(zhuǎn)移到不同種類的氨基酸上（主要包括絲氨酸S、蘇氨酸T、酪氨酸Y），從而使蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾的過程。

2. 磷酸化修飾類型

根據(jù)磷酸氨基酸殘基的不同，可將磷酸化蛋白質(zhì)分為4類，即O-磷酸鹽蛋白質(zhì)、N-磷酸鹽蛋白質(zhì)、?；姿猁}蛋白質(zhì)和S-磷酸鹽蛋白質(zhì)。

? O-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過羥氨基酸（如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸）的磷酸化形成

? N-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成

? ?；姿猁}蛋白質(zhì)通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成

? S-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過半胱氨酸磷酸化形成

到這里，不得不提起如何鑒定磷酸化蛋白的修飾位點(diǎn)以及類別？

3. 蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定方法

1. Western Blotting

免疫印跡技術(shù)是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、根據(jù)特定抗原-抗體的特異性反應(yīng)來檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白質(zhì)的免疫生化分析方法。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)

? 檢測(cè)特異性高

? 能夠特異鑒定單個(gè)磷酸化位點(diǎn)

? 磷酸化鑒定受磷酸化抗體限制，高效特異性的磷酸化抗體制備較難；新發(fā)現(xiàn)的磷酸化位點(diǎn)往往缺乏有效的磷酸化檢測(cè)抗體

2. 同位素標(biāo)記（Isotope Labeled）結(jié)合免疫印跡法

此方法的原理是當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生磷酸化時(shí)，放射性32P的摻入和分子質(zhì)量變化引起的凝膠遷移（gelshift），再通過免疫印跡方法檢測(cè)同位素標(biāo)記，從而達(dá)到鑒定磷酸化蛋白的目的。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)

? 檢測(cè)技術(shù)靈敏并且直觀

? 常用于體外磷酸化反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)

? 磷酸化鑒定不受抗體限制

? 可同時(shí)分析多個(gè)蛋白磷酸化

3. Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳通過連接在丙烯酰胺分子上的雙核金屬（如Mn2+）配合物對(duì)磷酸基團(tuán)的親和，造成磷酸化蛋白遷移的滯留，再將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用相應(yīng)蛋白的抗體識(shí)別，根據(jù)遷移滯留檢測(cè)蛋白磷酸化。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)

? 無放射危害

? 鑒定不受限于特異性識(shí)別蛋白質(zhì)磷酸化的抗體

? 適用于大規(guī)模磷酸化蛋白分析

? 與質(zhì)譜鑒定兼容，進(jìn)行更為精細(xì)的分析鑒定

4. 質(zhì)譜鑒定法

在質(zhì)譜分析中，先使試樣中各組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子，然后經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，生成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，在磁場(chǎng)的作用下，質(zhì)荷比相同的離子會(huì)被聚焦到同一點(diǎn)上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦于不同點(diǎn)上，因此獲得區(qū)分不同質(zhì)荷比離子的質(zhì)譜圖。與未經(jīng)修飾的肽段相比，磷酸基團(tuán)修飾的肽段在相對(duì)分子質(zhì)量上就會(huì)增加79.983，由此在質(zhì)譜圖中能夠與未修飾肽段進(jìn)行區(qū)分。

固相金屬親和色譜IMAC

固相金屬離子親和色譜利用的是磷酸基團(tuán)與固相化的金屬離子有高親和力,可有效吸附磷酸化基團(tuán)，從而達(dá)到富集磷酸化肽段的效果。鰲合底物上的金屬離子通常是Fe3+或Ga3+，可以選擇性地與磷酸化肽中的磷酸部分相結(jié)合,并且在高pH或磷酸緩沖液中磷酸化肽可以釋放出來。但是這個(gè)方法不能夠有效富集不與IMAC結(jié)合的磷酸化肽段。

pY-1000基序抗體富集

高親和性抗體可以從復(fù)雜混合物中免疫沉淀特定的蛋白，選擇性分離磷酸化蛋白。其中，酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的單克隆抗體是已知的較好的檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)的抗體，它具有較強(qiáng)的親和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。并且酪氨酸磷酸化的相對(duì)比例極低，只占磷酸組的1%，但在腫瘤領(lǐng)域和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方向卻是重中之重。用上述TiO2和IMAC方法很難富集到，目前利用基序抗體在肽段水平上免疫富集酪氨酸磷酸化是分析此磷酸化的首選方法。