8+線粒體自噬+鐵死亡+分型+實驗
腎臟缺血再灌注損傷（IRI）是腎移植過程中不可避免的事件。線粒體自噬、鐵死亡以及相關(guān)的免疫微環(huán)境（IME）已被證明在腎臟IRI中起重要作用。然而，與線粒體自噬相關(guān)的IME基因在IRI中的作用仍不清楚。本研究旨在基于線粒體自噬相關(guān)的IME基因構(gòu)建IRI預(yù)后的預(yù)測模型。
1. MRG/FRG表達
作者比較了DBD、DCD和LD的IR和pre-IR樣本中MRGs/FRGs的表達，并確定了在這三組中有顯著差異表達的六個MRGs和六個FRGs（圖1A）。熱圖顯示了不同樣本中MRG/FRG的表達情況（圖1B-D）。差異表達的MRGs包括FUN14結(jié)構(gòu)域含1（FUNDC1）、外線粒體膜轉(zhuǎn)位酶6（TOMM6）（均下調(diào)）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（MAP1LC3B）、隔離體1（SQSTM1）、泛素B（UBB）和泛素C（UBC）（均上調(diào)）。差異表達的FRGs包括活化轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）、Kruppel 2（KLF2）、鋅指蛋白36（ZFP36）、細胞周期依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）、生長分化因子15（GDF15）和丙酮酸脫氫酶激酶（PDK4）（均上調(diào)）。作者還通過相關(guān)性分析檢測了MRG和FRG的表達相關(guān)性。相關(guān)性矩陣顯示在圖1E-G中。接下來，作者使用GSE90861和GSE126805數(shù)據(jù)集驗證了12個差異表達的MRGs/FRGs，并發(fā)現(xiàn)這12個MRGs/FRGs在這兩個數(shù)據(jù)集中都有差異表達，其表達趨勢與作者分析中所發(fā)現(xiàn)的一致。
圖1 不同ially expressed MRGs/FRGs的熱圖和相關(guān)性分析
2. 不同表達的MRGs/FRGs的PPI、miRNA、TF和小分子化合物相互作用網(wǎng)絡(luò)
作者構(gòu)建了12個差異表達的MRGs/FRGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)ZFP36、UBC、GDF15、MAP1LC3B、CDKN1A、SQSTM1、TOMM6、UBB、ATF3、KLF2、PDK4和FUNC1分別與187、186、119、116、104、75、59、59、43、12、12和2（ZNF71和MAZ）個轉(zhuǎn)錄因子（TFs）相關(guān)聯(lián)。miRNA相互作用分析顯示，CDKN1A、KLF2、ZFP36、UBC、UBB、MAP1LC3B、SQSTM1、ATF3、GDF15和PDK4分別與331、107、53、49、42、42、27、24、23和6（hsa-mir-16-5p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-103a-3p、hsa-mir-182-5p、hsa-mir-122-5p和hsa-mir-335-5p）個miRNA相關(guān)聯(lián)。此外，小分子化合物相互作用分析顯示，CDKN1A、ATF3、GDF15、SQSTM1、MAP1LC3B、ZFP36、PDK4、KLF2、UBC、UBB、FUNDC1和TOMM6分別與618、204、202、166、95、72、56、45、29、22、6（對乙酰氨基酚、兒茶素、環(huán)孢霉素、葡萄籽原花青素、K7174和四氯二苯并二噻吩）個，以及7（黃曲霉毒素B1、砷、氯硝烯、硫酸銅、環(huán)孢霉素、K7174和丙戊酸）個小分子化合物相關(guān)聯(lián)。
3. 分子亞型劃分
NMF亞型分析顯示，聚類系數(shù)在rank=2時開始下降，表明最佳亞型數(shù)量為2（圖2A）。亞型的熱圖如圖2B所示。主成分分析顯示，樣本可以通過這兩個亞型清晰地區(qū)分開來（圖2C）。亞型與預(yù)后的相關(guān)分析表明，亞型之間的生存時間差異顯著，亞型2患者的預(yù)后優(yōu)于亞型1患者（圖2D）。免疫細胞浸潤分析顯示，亞型1患者的靜息樹突狀細胞、M2巨噬細胞、靜息NK細胞、CD8+ T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）浸潤顯著增加（P < 0.01），而亞型2患者的M1巨噬細胞、中性粒細胞、活化記憶CD4+ T細胞和γδ T細胞浸潤顯著增加（P < 0.05）（圖2E）。MRGs/FRGs的表達，即FUNDC1、MAP1LC3B、SQSTM1、UBB、ATF3、KLF2、ZFP36、CDKN1A和PDK4，在兩個亞型之間存在顯著差異（P < 0.05）（圖2F）。
圖2 分子亞型分型
4. 預(yù)后標志物選擇、風(fēng)險評分計算和評估
作者使用LASSO回歸選擇了七個MRGs/FRGs（FUNDC1、SQSTM1、UBB、UBC、KLF2、CDKN1A和GDF15）作為預(yù)后標志物。ROC曲線的AUC為0.73，表明具有良好的預(yù)測能力。高/低表達組中七個候選基因的生存曲線如圖S4D-J所示。根據(jù)LASSO回歸確定的候選預(yù)后標志物的系數(shù)計算出風(fēng)險評分（RS）。
RS預(yù)測生存的ROC曲線顯示出良好的預(yù)測能力（圖3A）。使用maxstat，作者確定了預(yù)測接受腎移植患者生存的最佳RS截斷值為-25.0716。然后，作者根據(jù)這個截斷值將接受腎移植的患者分為高RS組和低RS組，并移除沒有生存信息的患者。高RS組的患者預(yù)后明顯較差，與低RS組相比（P < 0.0001）（圖3B）。
圖3 風(fēng)險評分和評估
此外，作者比較了高RS組和低RS組之間的免疫細胞浸潤程度（圖3C）。作者的分析顯示，高RS組中B細胞、中性粒細胞、T細胞和M1巨噬細胞的浸潤程度更高（P < 0.01），而低RS組中記憶B細胞、樹突狀細胞（DCs）、M2巨噬細胞、靜止NK細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和T細胞的浸潤程度更高（P < 0.01）。
5. RS組中的差異基因表達和富集分析
作者對這些差異表達基因進行了富集分析。KEGG分析顯示，這些差異表達基因富集在金黃色葡萄球菌感染、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、蛋白質(zhì)消化和吸收以及百日咳等方面。此外，GO分析顯示，差異表達基因與生物過程（BP）相關(guān)，如體液免疫應(yīng)答、白細胞介導(dǎo)的免疫、基于免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域的體液免疫應(yīng)答、淋巴細胞介導(dǎo)的免疫以及免疫應(yīng)答的激活；與分子功能（MF）相關(guān)，如抗原結(jié)合、CXCR趨化因子受體結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合和肝素結(jié)合；以及與細胞組分（CC）相關(guān)，如細胞外側(cè)、血液微粒、含膠原的細胞外基質(zhì)、膠原三聚體和分泌顆粒腔。
6. 低氧導(dǎo)致HK2細胞受損
細胞在常氧組和低氧組中的存活率通過流式細胞術(shù)進行測量。作者的結(jié)果表明，在低氧組中，壞死和凋亡的HK2細胞數(shù)量遠高于常氧組（圖4A），同時伴隨著細胞內(nèi)ROS水平的增加。作者還發(fā)現(xiàn)，在低氧后，線粒體膜發(fā)生了去極化，這表明低氧可能會損害線粒體功能（圖4B）。
圖4 在缺氧環(huán)境下，HK2細胞會引發(fā)鐵死亡，并伴隨著炎癥因子的分泌
接下來，作者通過收集培養(yǎng)上清液來檢查不同條件下HK2細胞的炎癥反應(yīng)。缺氧上調(diào)了HK2細胞中炎癥介質(zhì)的表達（圖4C）。此外，在缺氧后，HK2細胞培養(yǎng)上清液中的鐵死亡相關(guān)標志物的表達也增加了，這表明缺氧加劇了HK2細胞的鐵死亡（圖4D）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明缺氧導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷，同時增加了炎癥介質(zhì)的表達、線粒體自噬和鐵死亡。
7. IRI導(dǎo)致小鼠腎功能受損
作者比較了假手術(shù)組和缺血再灌注組小鼠的腎功能，發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致腎功能受損（圖5A）。缺血再灌注引起嚴重的腎小管損傷，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞壞死和脫落（圖5B）。TUNEL染色結(jié)果也表明缺血再灌注引起嚴重的腎損傷。接下來，作者發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)在模型組中明顯過表達，與假手術(shù)組相比（圖S8）。此外，質(zhì)譜流式細胞術(shù)揭示腎缺血再灌注顯著增加了免疫細胞對腎臟的浸潤（圖5C）。模型組與假手術(shù)組相比，鐵死亡標志物的水平差異顯著（P < 0.05）。此外，作者還觀察了腎組織中FRG和MRG的表達，表明缺血再灌注可以上調(diào)FRG和MRG的表達誘導(dǎo)線粒體自噬（圖5D）。透射電子顯微鏡證實腎缺血再灌注導(dǎo)致線粒體萎縮，線粒體嵴消失減少，線粒體膜密度增加，自噬體豐富（圖5E）。
圖5 腎臟缺血再灌注損傷會導(dǎo)致腎功能不全和小鼠中的損傷
總結(jié)
總之，線粒體在應(yīng)激條件下（如缺血再灌注損傷）極易受損，導(dǎo)致功能紊亂。線粒體分裂和融合之間的動力學(xué)調(diào)控機制已在臨床人體樣本、HK2細胞和急性腎臟缺血再灌注損傷的小鼠模型中得到證明。維持線粒體動力學(xué)的穩(wěn)態(tài)可能是緩解急性缺血再灌注損傷的新研究方向，也可能成為藥物作用的新靶點。然而，還需要進一步的研究和驗證才能在臨床實施中應(yīng)用。
