細(xì)胞培養(yǎng)和輻照處理

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和PC9獲自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所（中國上海）。將細(xì)胞置于 T-75 燒瓶中，并在含 10% 胎牛血清（CELLIGENT，新西蘭）的 RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BASALMEDIA，中國）中，在 5% CO2 和 37°C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射治療中心，使用RS2000生物X射線生物輻照儀（美國喬治亞州），在室溫下以280 keV的能量、1.8 Gy/min的劑量率對(duì)細(xì)胞進(jìn)行輻照。為了建立抗放療細(xì)胞系，A549 和 PC9 細(xì)胞重復(fù)接受 4 Gy X 射線照射，總劑量為 56Gy。兩個(gè)子匯合處 75-cm?2將細(xì)胞燒瓶重復(fù)暴露于 4 Gy X 射線照射。第一次照射時(shí)燒瓶中存在的細(xì)胞總數(shù)約為 1 × 10?7。允許間隔3至5天暴露已生長(zhǎng)至80%密度的受輻射細(xì)胞，以便細(xì)胞能夠存活。通過這種方式，每次照射時(shí)存在的細(xì)胞數(shù)量大致保持恒定。每次照射時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，每五個(gè)部分后，合并兩個(gè)燒瓶的內(nèi)容物，并將一小部分分別鋪板。這些細(xì)胞用于克隆形成測(cè)定并建立冷凍儲(chǔ)備。通過持續(xù)低劑量照射而獲得放射治療抗性的細(xì)胞系分別命名為A549IR和PC9IR。

實(shí)時(shí)定量 PCR (qRT-PCR)

通過TRIzol從每個(gè)燒瓶中的細(xì)胞系中提取總 RNA?，并使用 SYBR Green Master Mix 試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。β-肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)源對(duì)照。引物序列如下：AURKA，正向5-GGTCAGTACATGCTCCATCTT CCAG-3'，反向5'-AGAACTCCAAGGCTCCAGAGATCC-3'；NAPSA，正向 5' -CTTCAGTGTGCCCTGCTGGTTAC-3'，反向 5' - CATCTACCCGCCCAGTTCCATATTG-3'；和SHC1，正向5'-TGAGGGTGTGGTTCGGACTAAGG-3'，反向5'-CCGCAGA GATGATGGGCAAGTG-3'。使用比較Ct方法(2-?△△Ct?)分析數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)印跡分析

用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后加入冰冷的裂解緩沖液（Solarbio，中國）。以 12,500 rpm 和 4°C 收集細(xì)胞裂解物，并在上樣緩沖液中煮沸 10 分鐘。蛋白質(zhì)在 12.5% SDS-PAGE 凝膠上解析，轉(zhuǎn)移到 PVDF (0.2 μm) 膜上，并用 5% 脫脂奶粉封閉。使用以下一抗：LC3B (#43566, CST) 為 1:1000，SQSTM1/p62 (#8025, CST) 為 1:1000，GAPDH (#5174, CST) 為 1:5000。按照制造商的說明稀釋 LC3b 和 p62 的一抗，并在 4°C 搖床上低速孵育過夜。然后，將二抗在搖床上低速室溫孵育2小時(shí)。PVDF膜用PBS清洗3次，并使用ECL Plus試劑盒觀察免疫反應(yīng)過程。

集落形成測(cè)定

按照預(yù)實(shí)驗(yàn)在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)300個(gè)細(xì)胞，鋪板后24h細(xì)胞完全貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞。允許細(xì)胞在體外繼續(xù)增殖六代以上。大約12-14天后，用PBS洗滌細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，最后用結(jié)晶紫染色。計(jì)算具有> 50個(gè)細(xì)胞的克隆的數(shù)量。測(cè)量每個(gè)細(xì)胞系的鋪板效率（PE），并使用方程SF=（形成的集落數(shù)）/（接種的細(xì)胞數(shù)×假輻射組的鋪板效率）×100%計(jì)算存活分?jǐn)?shù)。

結(jié)果

LUAD放療中涉及的關(guān)鍵基因的鑒定

為了確定與放療相關(guān)的基因，我們進(jìn)行了 WGCNA。樣本聚類結(jié)果顯示沒有異常樣本，最佳軟閾值為3，其中R?2約為0.85。合并相似模塊后，我們最終確定了 11 個(gè)模塊，brown4 模塊與放射治療最相關(guān)（cor = -0.3，p 值 < 0.01）。因此，brown4 模塊中的 1,900 個(gè)基因被用于下游分析。

LUAD 中 DERRAG 的鑒定

RS 組和 RR 組之間共鑒定出 1121 個(gè) DEG。前 100 個(gè) DEG 的表達(dá)式顯示在熱圖中（。將 1121 個(gè) DEG 與 1900 個(gè)模塊基因和 1183 個(gè) ATG 相交后，AURKA、CTSV、DAPK1、FGFR3、NAPSA、PLCH1、RGL1、SESN3、SHC1、SLC7A5和SMPD1被識(shí)別為 LUAD 中的 DERRAG。DERRAGs顯著富集13種細(xì)胞成分，包括板層體、溶酶體腔、液泡腔、減數(shù)分裂紡錘體、TORC2復(fù)合體、原核、GATOR2復(fù)合體、紡錘體極中心體、TOR復(fù)合體、Seh1相關(guān)復(fù)合體、生殖細(xì)胞核、內(nèi)溶酶體和微絨毛膜以及溶酶體、Ras 信號(hào)傳導(dǎo)和膀胱癌的通路

自噬相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

我們研究了 DERRAG 的預(yù)后價(jià)值。通過單變量 Cox 回歸分析，NAPSA、SHC1、AURKA、CTSV和SLC7A5與 LUAD 的 OS 密切相關(guān)。然后，將5個(gè)基因輸入多元Cox回歸，進(jìn)一步選擇SHC1、NAPSA和AURKA建立自噬相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模型。根據(jù)SHC1、NAPSA、AURKA的系數(shù)和表達(dá)量計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將病例分為兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組。高危組中SHC1和AURKA的表達(dá)顯著升高，而NAPSA的表達(dá)較低。此外，兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存率也存在顯著差異。通過ROC曲線考察風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)效率，風(fēng)險(xiǎn)模型顯示出中等準(zhǔn)確度，曲線下面積（AUC）> 0.6。在內(nèi)部TCGA中也獲得了一致的結(jié)果和外部GSE50081數(shù)據(jù)集

LUAD建立自噬相關(guān)列線圖

接下來，通過單變量分析研究獨(dú)立預(yù)后因素。我們發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、腫瘤疾病階段、患者吸煙史類別、診斷年齡和性別與預(yù)后顯著相關(guān)。然后對(duì)這些因素進(jìn)行多變量分析，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤疾病分期仍然與預(yù)后顯著相關(guān)，表明它們是 LUAD 的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，我們使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤疾病階段構(gòu)建列線圖來預(yù)測(cè)生存率。校準(zhǔn)曲線顯示預(yù)測(cè)的 1 年和 3 年 OS 接近實(shí)際觀察到的 OS

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與細(xì)胞增殖密切相關(guān)

為了闡明 LUAD 中這些預(yù)后特征的相關(guān)途徑，進(jìn)行了 GSEA 分析。高危組基因富集于與細(xì)胞增殖相關(guān)的生物過程，包括細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)變、DNA構(gòu)象改變、染色質(zhì)組裝或分解、DNA依賴性DNA復(fù)制、染色體分離、DNA包裝、DNA復(fù)制、減數(shù)分裂 I 細(xì)胞周期過程、雙鏈斷裂修復(fù)和減數(shù)分裂細(xì)胞周期。與 GO 結(jié)果一致，當(dāng)應(yīng)用 KEGG 時(shí)，高危組中細(xì)胞增殖相關(guān)通路也得到富集

低危組和高危組的免疫微環(huán)境不同

考慮到免疫微環(huán)境在 LUAD 進(jìn)展中的重要性，我們檢查了兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫浸潤狀況。我們觀察到CD8 T細(xì)胞與細(xì)胞毒性細(xì)胞、iDC與DC、巨噬細(xì)胞與DC、巨噬細(xì)胞與iDC、NK CD56dim細(xì)胞與細(xì)胞毒性細(xì)胞、T細(xì)胞與B細(xì)胞、T細(xì)胞與細(xì)胞毒性細(xì)胞、Th1細(xì)胞之間存在中度或強(qiáng)相關(guān)性。 LUAD 中的細(xì)胞毒性細(xì)胞、Th1 細(xì)胞和 DC、Th1 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、Th1 細(xì)胞和 T 細(xì)胞、Treg 和 T 細(xì)胞、Treg 和 Th1 細(xì)胞。此外，aDC、巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK CD56dim 細(xì)胞、DC、Tcm、iDC、Treg、T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Th1 細(xì)胞和 Th2 細(xì)胞的浸潤在兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組中顯著不同。AURKA 表達(dá)與 Th2 細(xì)胞豐度呈顯著正相關(guān)，NAPSA表達(dá)與Th2細(xì)胞和DC浸潤呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。盡管SHC1表達(dá)與多個(gè)差異浸潤的免疫細(xì)胞具有顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，但它們的相關(guān)性非常弱(|cor| < 0.3

通過構(gòu)建與原代細(xì)胞相比的耐藥細(xì)胞系來驗(yàn)證 SHC1、NAPSA 和 AURKA 基因、放療敏感性和自噬之間的關(guān)系

通過細(xì)胞的間隔照射構(gòu)建抗輻射細(xì)胞。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)抗輻射細(xì)胞系在克隆形成實(shí)驗(yàn)中對(duì)輻射有抵抗力，其IR后的細(xì)胞存活率明顯高于原代細(xì)胞的存活率。

通過蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)抗輻射細(xì)胞的自噬水平升高。通過 qRT-PCR 驗(yàn)證，放射抗性細(xì)胞中 RRAG（SHC1、AURKA）的表達(dá)高于原代細(xì)胞。然而，在放射抗性細(xì)胞和原代細(xì)胞之間未觀察到NAPSA基因表達(dá)的顯著差異。NAPSA基因主要在LUAD和腎癌中高表達(dá)；因此，NAPSA基因可能與組織分型密切相關(guān)。我們用于構(gòu)建抗輻射細(xì)胞的原代細(xì)胞均為L(zhǎng)UAD細(xì)胞；因此，放射抗性細(xì)胞和原代細(xì)胞之間的NAPSA基因表達(dá)沒有顯著差異。