生物分離工程

第一章(緒論)

生物分離工程的定義和過程

生物分離工程定義（名詞解釋）：

為提取生物產(chǎn)品時所需的原理、方法、技術及相關硬件設備的總稱，指從發(fā)酵液、動植物細胞培養(yǎng)液、酶反應液和動植物組織細胞與體液等中提取、分離純化、富集生物產(chǎn)品的過程。

過程：

目標產(chǎn)物捕獲

目標產(chǎn)物初步純化(萃取、沉淀、吸附等方法)

目標產(chǎn)物高度純化和精制

細胞分離三種手段 ： 重力沉降 離心沉降 過濾

第二章

離心分離原理和方法：

原理：離心沉降是在離心力的作用下發(fā)生的。

單位質(zhì)量的物質(zhì)所受到的離心力：

式中：

r為離心半徑，即從旋轉(zhuǎn)軸心到沉降顆粒的距離；

ω為旋轉(zhuǎn)角速度；

N為離心機的轉(zhuǎn)數(shù)，s－1

方法：（1）差速離心分級

（2）區(qū)帶離心（差速區(qū)帶離心 、 平衡區(qū)帶離心）

離心分離設備：

離心力（轉(zhuǎn)速)的大小 ：低速離心機、 高速離心機、 超離心機

按用途：分析性 、制備性

按工業(yè)應用 ：管式離心機 、 碟片式離心機

實驗室用以離心管式轉(zhuǎn)子離心機 ，離心操作為間歇式

懸浮液的預處理方法和目的 ：

方法 ：

1.加熱：最簡單和最廉價的處理方法。黏度、促凝聚、固體成分體積、破壞凝膠結(jié)構、增加空隙率

調(diào)pH值：方法簡單有效、成本低廉

2.凝聚：在凝聚劑(如鋁鹽、鐵鹽、石灰和NaCl)作用下，細胞蛋白質(zhì)等膠體去穩(wěn)定，并聚集成1mm大小的凝聚塊的過程。（機理：破壞雙電層，水解后膠體吸附，氫鍵結(jié)合等）

3.絮凝：在絮凝劑高分子聚合電解質(zhì)的作用下，膠體顆粒和聚合電解質(zhì)交連成網(wǎng)，形成10mm大小的絮凝團過程。（機理：絮凝劑主要起中和電荷、橋架和網(wǎng)絡作用）

4.惰性助濾劑：一種顆粒均勻、質(zhì)地堅硬的粒狀物質(zhì)，用于擴大過濾表面的適應范圍，減輕細小顆粒的快速擠壓變形和過濾介質(zhì)的堵塞。（ 使用方法：預涂層；按一定比率混合。

助濾劑種類：硅藻土、纖維素、未活化的炭、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣等。）

目的 ：提高過濾速度和過濾質(zhì)量是過濾操作的目標。

各種細胞破碎技術原理和優(yōu)缺點：

原理：許多生物產(chǎn)物在細胞培養(yǎng)過程中保留在細胞內(nèi)，需破碎細胞，使目標產(chǎn)物選擇性地釋放到液相。破碎的細胞或其碎片去除后，上清液用于進一步的分離純化。

細胞破碎技術分為：機械破碎法、化學法、物理滲透法

機械法和化學法的比較

機械破碎法缺點：

A、高能、高溫、高噪音、高剪切力，易使產(chǎn)品變性失活；

B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；

C、細胞碎片大小不一，難分離。

化學破碎法缺點：

A、費用高；

B、化學或生化試劑的添加引起新的污染；

C、破碎速度低，效率差，一般只有有限的破碎，常與機械

法連用。

物理滲透法

優(yōu)點：條件比較溫和，有利于目標產(chǎn)物的高活力釋放回收。

缺點：破碎效率較低、產(chǎn)物釋放速度低、處理時間長、不適于大規(guī)模細胞破碎，局限于實驗室規(guī)模的小批量使用。

包含體的解決方法（一般步驟）：

（一）包含體的分離純化

（二）包含體溶解（可溶性變性、還原蛋白質(zhì)）

（三）變性蛋白質(zhì)的復性和重新氧化

（四）蛋白質(zhì)一般的分離純化

第三章

沉淀的概念與結(jié)晶的區(qū)別：

沉淀：

沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象。具有濃縮與分離的雙重作用。

聯(lián)系：在本質(zhì)上都是新相析出的過程，主要是物理變化。

區(qū)別：結(jié)晶為同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出；沉淀為不定形的固體顆粒，構成成分復雜，純度低。

蛋白質(zhì)表面性質(zhì)：

1.蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團形成的荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。

2.蛋白質(zhì)水溶液呈膠體性質(zhì)

3.使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液、凝聚沉淀的因素：水化層和雙電層

影響鹽析的因素：

無機鹽（種類、濃度）、溫度和pH值

硫酸銨鹽析的特點：

價格便宜、溶解度大且受溫度影響很小、能穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）。

幾種沉淀的方法和優(yōu)缺點：

（鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、熱沉淀的原理和優(yōu)缺點）

1.鹽析沉淀 原理

蛋白質(zhì)溶液的離子強度增大時，蛋白質(zhì)表面的雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。鹽離子的水化作用使蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)附近的水化層脫離蛋白質(zhì)，暴露出疏水區(qū)域，增大了蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)之間的疏水相互作用，容易發(fā)生凝集，進而沉淀。

優(yōu)點：鹽析廣泛應用于各類蛋白質(zhì)的初步純化和濃縮。在某些情況下還可用于蛋白質(zhì)的高度純化。

缺點：利用鹽析沉淀得到的目標產(chǎn)物中含鹽量較高，一般在鹽析沉淀后，需進行脫鹽處理，才能進行后續(xù)的分離操作（如離子交換色譜）。

2.等電點沉淀 原理

蛋白質(zhì)在pH值為其等電點的溶液中凈電荷為零，蛋白質(zhì)之間靜電排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白質(zhì)在pH值等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀的方法稱為等電點沉淀。

優(yōu)點：無需后續(xù)的脫鹽操作。

缺點：沉淀操作的pH過低時，容易引起目標蛋白質(zhì)變性。

3.有機溶劑沉淀 原理

向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有機溶劑，水的活度降低。隨著有機溶劑濃度的增大，水對蛋白質(zhì)分子表面荷電基團或親水基團的水化程度降低，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而凝聚和沉淀。

優(yōu)點：有機溶劑密度較低，易于沉淀分離；與鹽析法相比，沉淀產(chǎn)品不需脫鹽處理

缺點：易引起蛋白質(zhì)變性，必須在低溫下進行

4.熱沉淀

在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀。根據(jù)蛋白質(zhì)間熱穩(wěn)定性的差別進行蛋白質(zhì)熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標產(chǎn)物。

第四章

膜分離技術的類型：

以濃度差為推動力：透析

以電場力為推動力：電滲析

以推動力分類 以靜壓力差為推動力：微濾；超濾；反滲透

以蒸氣壓差為推動力的過程：滲透氣化

微濾(microfiltration, MF)

超濾(untrafiltration, UF)

反滲透(reverse osmosis, RO)

以分離應用領域分類 透析(Dialysis, DS)

電透析(electrodialysis, ED)

親和過濾(affinity filtration, AF)

滲透氣化(pervaporation, PV)

分析比較反滲透、納濾、超濾和微濾的共同點和差別：

微濾、超濾、納濾、反滲透相同點：

①
膜兩側(cè)壓力差為推動力；

②
按體積大小而分離；③膜的制造方法、結(jié)構和操作方式都類似。

微濾、超濾、納濾、反滲透區(qū)別：

① 膜孔徑：微濾0.1-10mm > 超濾0.01-0.1m > 納濾0.001-0.01mm > 反滲透 小于0.001mm

② 分離粒子：微濾截留固體懸浮粒子，固液分離過程；超濾、納濾、反滲透為分子級水平的分離；

③ 分理機理：微濾、超濾和納濾為截留機理，篩分作用；反滲透機理是滲透現(xiàn)象的逆過程：

④ 壓差：微濾、超濾和納濾壓力差不需很大0.1-0.6 MPa

滲透氣化的原理和應用：

原理：疏水膜的一側(cè)通入料液，另一側(cè)抽真空，使膜兩側(cè)產(chǎn)生溶質(zhì)分壓差。在分壓差的作用下，料液中的溶質(zhì)溶于膜內(nèi)，擴散通過膜，在透過側(cè)發(fā)生氣化，氣化的溶質(zhì)被膜裝置外設置的冷凝器冷凝回收。疏水性較大的溶質(zhì)易溶于疏水膜，滲透速度高，在透過一側(cè)得到濃縮。

優(yōu)點：溶質(zhì)發(fā)生相變，透過側(cè)溶質(zhì)以氣體狀態(tài)存在，因此消除了滲透壓的作用，可在較低的壓力下進行，適于高濃度混合物的分離。

用途：利用溶質(zhì)之間膜透過性的差別，特別適用于共沸物和揮發(fā)度相差較小的雙組分溶液的分離。

不對稱膜的結(jié)構：

膜在厚度上的孔道結(jié)構不均勻，由起膜分離作用的表面活性層(0.2-0.5μm)和起支撐作用的惰性層(50-100μm)構成。

濃度極化：膜分離操作中，所有溶質(zhì)均被透過液傳送到膜表面，不能完全透過膜的溶質(zhì)受到膜的截留作用，在膜表面附近濃度升高。這種在膜表面附近濃度高于主體濃度的現(xiàn)象稱為濃度極化。

凝膠極化：當膜表面附近的濃度超過溶質(zhì)的溶解度時，溶質(zhì)會析出，形成凝膠層。分離含有菌體、細胞和其他固形成分的料液時，也會在膜表面形成凝膠層。這種現(xiàn)象稱為凝膠極化。

截留相對分子量：一般將在截留率為90%的溶質(zhì)分子量定義為膜的截留分子量。

過濾速度與壓力關系：

流速

傳質(zhì)系數(shù)隨流速的增大而提高。因此，流速增大，透過通量也增大。

壓力

1.當Dp較小時， 無濃度極化層， Jv與Dp成正比，此時：

2.當Dp逐漸增大時，有濃差極化，Jv的增長速率減慢， 此時：

3.當Dp繼續(xù)增加時，形成凝膠層，且厚度隨壓力的增大而增大，所以Jv不再隨Dp的增加。此時的Jv為此流速下的極限值(Jlim)，用方程：

4.lim隨料液濃度上升而下降ˉ，隨流速(攪拌速度) 上升而上升

第五章

問：根據(jù)弱電解質(zhì)的萃取理論分析為什么青霉素在酸性（pH≤2.5）條件下，而紅霉素卻要在堿性（pH≥9.8）條件下才能被萃取到丁酯中去呢？

青霉素萃取反萃取

青霉素是有機酸，pH值對其分配系數(shù)有很大影響。選擇適當?shù)膒H，有利于提高青霉素的收率, 還可根據(jù)共存雜質(zhì)的性質(zhì)和分配系數(shù)提高萃取的選擇性。

1）青霉素萃?。狠^低pH下有利于青霉素在有機相中的分配。

2）青霉素反萃?。簆H大于6.0時，青霉素幾乎完全分配于水相中。

雙水相系統(tǒng)是指某些高分子聚合物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當?shù)臐舛热芙鈺纬苫ゲ幌嗳艿膬伤嗷蚨嗨嘞到y(tǒng)。

雙水相系統(tǒng)的概念，及常見的雙水相系統(tǒng)：

雙水相系統(tǒng)：是指某些高分子聚合物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當?shù)臐舛热芙鈺纬苫ゲ幌嗳艿膬伤嗷蚨嗨嘞到y(tǒng)。

蛋白質(zhì)的分配平衡 ：靜電作用，疏水作用。

液膜概念及液膜萃取的優(yōu)點：

液膜：由水溶液或有機溶劑（油）構成的液體薄膜。液膜可將與之不能互溶的液體分隔開來，使其中一側(cè)液體中的溶質(zhì)選擇性地透過液膜進入另一側(cè)，實現(xiàn)溶質(zhì)的分離。

優(yōu)點：液膜萃取可同時實現(xiàn)萃取和反萃取，這是液膜萃取法的主要優(yōu)點之一。

乳狀液膜的膜溶液組成：（填空題）

膜溶劑、表面活性劑 、添加劑

液膜萃取三種機理：

單純遷移 、反萃相化學反應促進遷移、膜相載體輸送

問：為什么反膠團萃取可用于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離純化？溶解的推動力有哪些？

反膠團內(nèi)微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。因此反膠團萃取可用于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離純化。

溶解推動力有：靜電作用、空間相互作用、疏水性相互作用

超臨界流體萃取的概念、優(yōu)點和用途：

超臨界流體萃?。豪贸R界流體為萃取劑的萃取操作稱為超臨界流體萃取。

優(yōu)點和用途：超臨界流體粘度小、自擴散系數(shù)大，萃取速度高于液體萃取，特別適用于提取固體內(nèi)有用成分。

超臨界流體萃取設備和操作方法：（填空題）

超臨界流體萃取設備通常由溶質(zhì)萃取槽和萃取溶質(zhì)的分離回收槽構成，分別相當于萃取和反萃取。

根據(jù)萃取過程中超臨界流體的狀態(tài)變化和溶質(zhì)的分離回收方式不同，超臨界流體萃取操作主要分等溫法、等壓法和吸附法。

第六章

三種吸附作用力原理和各自脫附的方法：

物理吸附：基于吸附劑與溶質(zhì)之間的分子間力。溶質(zhì)在吸附劑上吸附與否或吸附量的多少取決于溶質(zhì)與吸附劑極性的相似性和溶劑的極性。可通過改變溫度、pH值和鹽濃度等物理條件脫附。

化學吸附：吸附劑表面活性點與溶質(zhì)之間發(fā)生化學鍵合、產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，吸附穩(wěn)定，不易脫附。采用破壞化學鍵合的化學試劑洗脫劑脫附。

離子交換：所用吸附劑稱為離子交換劑，表面鍵合離子基團或可離子化基團，通過靜電引力吸附帶有相反電荷的離子，吸附過程發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移。一般通過提高離子強度或調(diào)節(jié)pH值的方法洗脫。

離子交換劑的分類：

1.陽離子交換劑和陰離子交換劑

2.按離子交換劑適用的生物分子大小分類：小分子類交換劑和高分子類交換劑

固定床單柱吸附操作過程：

膨脹床吸附的用途：分析化學、純化G6PDH、污染物治理等、醫(yī)藥

第七章

色譜法概念和原理：

色譜法：是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，當流動相推動樣品中的組分通過固定相時，在兩相中進行連續(xù)反復多次分配，從而形成差速移動，達到分離的方法。

色譜分離的分類：（填空題）

按應用目的分類：分析性色譜 、制備性色譜

按固定相及流動相的狀態(tài)分類：氣相色譜、 液相色譜、超臨界流體色譜

按壓力分類：低壓色譜分離、中壓色譜分離、高壓色譜分離

按分離機理分類：凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相色譜、疏水性相互作用色譜、

親和色譜

分配系數(shù)：（名詞解釋）

，cs和cm分別為組份在固定相和流動相中的濃度。

保留時間：（名詞解釋）

試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)歷的時間?？捎脮r間/ 距離/體積單位表示。

保留體積：（名詞解釋）

指從進樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相體積。

柱效與流動相關系

柱層析三種方法

凝膠過濾層析分配系數(shù)、

凝膠過濾分配系數(shù)、洗脫次數(shù)和相對分子量的關系：

凝膠過濾色譜操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)m只是相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構（孔徑分布）的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強度等無關。

蛋白質(zhì)在凝膠介質(zhì)中的分配系數(shù)隨相對分子質(zhì)量的增大而減小。

排阻極限：指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。

溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分數(shù)。

床體積：1 g干燥凝膠溶脹后的體積。

凝膠過濾色譜：

原理：是利用凝膠過濾介質(zhì)為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相色譜法。

應用： 分離純化、脫鹽、相對分子質(zhì)量的測定

洗脫方法：恒洗脫液洗脫

離子交換色譜：

原理：是以離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫色譜法。

應用 ：分離純化生物產(chǎn)物

洗脫方法：線性梯度洗脫法 或 逐次洗脫法。

反相色譜：（概念）

反向色譜（RPC）利用表面非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差別進行分離純化的洗脫色譜法。

流通色譜：（概念）（灌注色譜）

指利用含有大穿透孔的介質(zhì)為固定相的液相色譜法，其分離模式包括前述的各種吸附色譜。

羥基磷灰石色譜吸附和洗脫的原理：

吸附原理：羥基磷灰石色譜(HAP)的吸附主要基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力，即在HAP晶體表面存在兩種不同的吸附晶面，各存在吸附點C和P，分別起陰、陽離子交換作用。

洗脫原理：HAP色譜通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法

問：利用疏水性色譜分離A和B的混合物時，在某操作條件下兩者分離度不理想，試述如何改善條件，提高分離度，說明理由。

（1）降低鹽濃度：疏水色譜中加入鹽有利于蛋白質(zhì)的吸附，鹽濃度越高，吸附容量越大。

（2）加入添加劑（如乙二醇等）：低濃度的添加劑有利于降低蛋白質(zhì)與配基之間的疏水作用力

（3）降低鹽濃度和添加劑同時使用

（4）降低洗脫操作溫度或降低洗脫液的PH值：溫度升高，疏水作用增強，蛋白質(zhì)的保留值增加。無論PH比pI大或小，都會使蛋白質(zhì)帶上電荷，此時如填料的配基不帶電荷，蛋白質(zhì)易于洗脫。

{老師提的幾點：（1）換填料（2）增加柱高（3）降低流速（4）降低進料量}

第八章

生物親和作用的概念和本質(zhì)：

概念：生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力。這種識別并結(jié)合的能力具有排他性。生物分子間的這種特異性相互作用稱為生物親和作用。

本質(zhì)：具有親和作用的分子對之間具有“鑰匙”和“鎖孔” 的空間結(jié)構關系。

親和結(jié)合作用，還需存在特殊的相互作用力：靜電作用、氫鍵、疏水相互作用、配位鍵、弱共價鍵

親和色譜原理和操作：

原理：親和吸附是利用親和吸附作用分離純化生物物質(zhì)的液相色譜法。

操作：與一般的固定床吸附操作相似，分進料、雜質(zhì)清洗、目標產(chǎn)物洗脫和色譜柱再生4個步驟。

親和色譜填料的制備過程：一般包括載體的選擇、載體的活化和配基的連接。

特異性和非特異性洗脫的特點：

特異性洗脫利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，脫附目標產(chǎn)物。

例如：Lys和Arg均為t-PA的抑制劑，利用固定化Lys為配基親和分離t-PA時，可用Arg溶液進行洗脫。

優(yōu)點：洗脫條件溫和，有利于保護產(chǎn)物的生物活性；由于僅特異性洗脫目標產(chǎn)物，對于特異性較低的親和體系或非特異性吸附較嚴重的物系，有利于提高目標產(chǎn)物的純度。

非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標產(chǎn)物的親和吸附作用，是使用較多的洗脫方法。

第九章

等電點聚焦的概念和原理：

原理：等電點聚焦利用蛋白質(zhì)和氨基酸等兩性電解質(zhì)具有等電點，在等電點的pH值下呈電中性，不發(fā)生泳動的特點進行電泳分離。

雙向電泳的概念和原理：

概念：雙向電泳同時利用分子尺寸和等電點這兩種性質(zhì)的差別進行蛋白質(zhì)等生物大分子的分離，即將普通凝膠電泳和等電點聚焦相結(jié)合，使溶質(zhì)在二維平面上得到分離。

原理：如圖：在凝膠電泳槽的y方向上凝膠具有逐漸增大的濃度分布， x方向上具有pH梯度。

ü x方向上電泳，使溶質(zhì)分子以等電點聚焦的形式泳動到其等電點處。

ü 然后將適當pH值的緩沖液滲透到凝膠中，在y方向上加電場使溶質(zhì)再次泳動。此時溶質(zhì)之間的泳動速度受荷電量及相對分子質(zhì)量的影響，相互之間得到進一步的分離。

不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳概念及其分離的原理：

凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成：濃縮膠(溶質(zhì)在此層得到濃縮)和分離膠(各個組分根據(jù)遷移率的差別分離)。

不連續(xù)性表現(xiàn)在：

1） 凝膠孔徑不連續(xù)性：

2） 緩沖體系離子組成及pH值的不連續(xù)性：

3） 電位梯度的不連續(xù)性：

在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，由于這三種物理效應，使樣品分離。