前言

口腔鱗癌（OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生于舌部、口底部、牙齦、頰黏膜等部位，具有高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性。早期OSCC患者（T1-2N0M0）采取以手術(shù)切除為主的治療，但仍有20%~40%的患者術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此，常規(guī)臨床TNM分無法有效區(qū)分此類患者，且其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因及機(jī)制仍不明。

2022年8月31日，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院泥艷紅、胡勤剛、丁亮團(tuán)隊(duì)在Nature Communications (IF: 17.694) 雜志上在線發(fā)表題為〝OXTRHigh?stroma fibroblasts control the Invasion Pattern of Oral Squamous Cell Carcinoma via ERK5 Signaling〞的研究論文，在口腔鱗癌（OSCC）復(fù)發(fā)的機(jī)制方面取得了重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控腫瘤浸潤(rùn)方式的成纖維細(xì)胞亞群，并提出了通過靶向此亞群來改變腫瘤浸潤(rùn)方式的策略，為減少腫瘤患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)腫瘤提供了新的治療思路。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1、WPOI亞型轉(zhuǎn)換與OSCC進(jìn)程密切相關(guān)

研究中共納入880 OSCC患者，包括早期和晚期患者。發(fā)現(xiàn)OSCC患者中存在5種POI亞型，其中WPOI 4-5與更嚴(yán)重的腫瘤侵襲相關(guān)，而WPOI 1-3更易發(fā)生在早期（圖1）。此外，WPOI 4-5患者的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的間充質(zhì)表型，其中36%的WPOI 4-5患者更傾向于發(fā)展為晚期OSCC，16%更容易發(fā)展為早期OSCC。而WPOI 1-3患者表現(xiàn)出相對(duì)較高的無復(fù)發(fā)生存期（早期 84% 與晚期 74%）和總生存期。Cox regression分析表明：WPOI是OSCC低生存率的一個(gè)重要預(yù)后因子（圖1）。因此作者推測(cè)POI的異質(zhì)性可歸因于間質(zhì)的復(fù)雜性和異質(zhì)性，最終引起了OSCC患者的術(shù)后預(yù)后不同（圖1）。

圖1 | WPOI 4-5亞型與OSCC進(jìn)展密切相關(guān)

2、基質(zhì)成纖維細(xì)胞參與了WPOI亞型轉(zhuǎn)換? ??

為了研究WPOI 1-3和WPOI 4-5亞型間的間質(zhì)特征差異，采用IHC評(píng)估不同的基質(zhì)細(xì)胞。collagen-I表達(dá)的基質(zhì)細(xì)胞在WPOI 1-3和WPOI 4-5亞型中表現(xiàn)出了顯著不同。由于基質(zhì)成纖維細(xì)胞是負(fù)責(zé)在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生膠原蛋白的關(guān)鍵細(xì)胞類型，因此作者獨(dú)立收集了150 名OSCC患者檢測(cè)其α-SMA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)α-SMA在WPOI 4-5亞型中相對(duì)較高（圖2）。從WPOI 1-5亞型中分別分離CAF細(xì)胞系用于后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)CAF的基質(zhì)重構(gòu)能力相對(duì)更強(qiáng)，而且可以顯著提高OSCC上皮細(xì)胞HSC3對(duì)CAF重構(gòu)基質(zhì)的侵襲能力、促進(jìn)類器官增殖等（圖2）。體內(nèi)驗(yàn)證證明CAF可以加速腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖2)。綜上所述，CAF參與了WPOI 4-5型腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移這一調(diào)控過程。

圖2 | CAF WPOI 4-5增強(qiáng)了OSCC的侵襲性

2、CAF WPOI 4-5亞型中OXTR高表達(dá)???

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)基因(RELN, MYH10, CACNB4, OXTR, CAV3, CHRM2等)、炎癥相關(guān)基因(RELN, IL21R, EDNRB, CAV3, OXTR等)和OXTR在CAF中顯著上調(diào)表達(dá)，因OXTR基因在相關(guān)研究中已有報(bào)道，因此將其作為后續(xù)研究的一個(gè)關(guān)鍵候選基因。定量發(fā)現(xiàn)WPOI 4-5的OXTR 表達(dá)增加，此外乳腺癌和胰腺癌分離的CAFs細(xì)胞系中OXTR表達(dá)也有所增加（圖3）。此外免疫組化顯示，OXTR在CAF的間質(zhì)成纖維細(xì)胞中富集，且80%以上WPOI 4-5患者的間質(zhì)OXTR高表達(dá)（圖3）。有趣的是，中度至高度 OXTR+ CAF 的 OSCC 患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)非常高。

圖3 | CAF WPOI 4-5以O(shè)XTR高表達(dá)為特點(diǎn)

4、OXTR缺失會(huì)損害ECM重建和腫瘤侵襲

為了探究OXTR表達(dá)在CAF 依賴的OSCC腫瘤侵襲中的作用，通過轉(zhuǎn)錄組分析了高或低OXTR水平的OSCC患者衍生的CAF中的基因表達(dá)情況，通路富集分析發(fā)現(xiàn)OXTR高表達(dá)與細(xì)胞粘附和ECM重塑密切相關(guān)，GSEA分析結(jié)果也與其一致。此外，OXTRCAFs細(xì)胞中PDGFRB和CDH2表現(xiàn)出高表達(dá)（圖4）。為了進(jìn)一步研究基質(zhì)細(xì)胞可塑性的控制，在超低粘附環(huán)境中將HN6 OSCC細(xì)胞系與OXTR或 OXTR CAF共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)類器官的增殖和形成異型球狀體的能力依賴于OXTRCAFs的存在。在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與共同注射OXTRHigh CAF和HN6細(xì)胞的小鼠具有更顯著的腫瘤負(fù)荷和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著增加（圖4）。為了研究OXTR在OSCC中的作用，建立s100a4-cre Oxtr-條件敲除小鼠模型，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞OXTR的缺失可以顯著抑制淋巴結(jié)遷移（圖4）。

圖4 | CAFs中OXTR的缺失以非配體的方式減弱了促侵襲功能

5、OXTRHigh CAFs衍生的趨化因子CCL26誘導(dǎo)CCR3+腫瘤細(xì)胞的間充質(zhì)表型

蛋白芯片檢測(cè)表明7個(gè)細(xì)胞因子（CXCL6, CCL26, CCL18, IL-1β, CCL7, CCL5, and TNFSF14/LIGHT）在OXTR CAFs中顯著上調(diào)表達(dá)，而OXTR的缺失抑制了除CXCL6外的6個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)。與之前結(jié)果類似，CCL18、CCL26和LIGHT在促進(jìn)OXTR CAF誘導(dǎo)的HN6侵襲方面具有最顯著的效果，但僅敲低 CCL26損害了OXTRHigh CAF依賴性腫瘤侵襲。因此，OXTR CAFs中的CCL26具有相對(duì)優(yōu)越的促進(jìn)腫瘤侵襲的能力，然而敲除CCL26受體CCR3也能夠抑制腫瘤侵襲（圖5）。在HNSCC患者中，CCR3表達(dá)上調(diào)且EMT通路相關(guān)基因也顯著升高（圖5），這更證明了OXTR CAF來源的CCL26是CCR3+腫瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

圖5 | CCL26是OXTR CAFs發(fā)揮功能必須的一個(gè)細(xì)胞因子

6、激活的ERK5對(duì)于OXTR CAFs的表型和功能維持是必不可少的

saRNA(Small activating RNA) 可以通過RNA干擾機(jī)制內(nèi)源性和選擇性地增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄，并已開發(fā)用于臨床。為了探索saRNA作為控制內(nèi)源性O(shè)XTR基因表達(dá)的作用，作者設(shè)計(jì)4個(gè)靶向OXTR基因啟動(dòng)子的候選saRNAs，其中sa-OXTR-4可以促進(jìn)CAFs中OXTR轉(zhuǎn)錄和翻譯（圖6）。此外發(fā)現(xiàn)CCL26基因在sa-OXTR組中更容易獲得，在sa-OXTR組中發(fā)現(xiàn)更多激活的核ERK5，且OXTR CAFs中的總ERK5水平和核磷酸化ERK5（p-ERK5）水平升高，而敲除ERK5會(huì)顯著抑制OXTR CAFs激活的CAF信號(hào)以及CCL26和OXTR的轉(zhuǎn)錄翻譯（圖6）。用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了OXTR和CCL26啟動(dòng)子中c-myc的潛在結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)突變會(huì)強(qiáng)烈抑制OXTR和CCL26啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（圖6）。

圖6 | OXTR/ERK5信號(hào)通路維持了OXTRHigh CAF中OXTR和CCL26的表達(dá)

7、抑制ERK5可減弱OXTR CAF的促侵襲作用

通過敲除sa-OXTR CAFs中ERK5探究ERK5抑制對(duì)WPOI 4-5亞型腫瘤的治療潛力，研究表明敲除ERK5有助于降低腫瘤的增殖和侵襲，且只有敲低ERK5才能通過降低LNM的發(fā)生率和腫瘤間充質(zhì)表型來克服纖維增生間質(zhì)（圖7）。WPOI 4-5患者間質(zhì)成纖維細(xì)胞的核ERK5和CCL26表達(dá)顯著升高，且間質(zhì)成纖維細(xì)胞中OXTR表達(dá)與ERK5的激活和CCL26表達(dá)顯著相關(guān)，表明OSCC患者的生存率較差（圖7）。綜上所述靶向ERK5的轉(zhuǎn)錄激活活性有望成為治療WPOI 4-5亞型腫瘤的一種有效治療策略。

圖7 | 在CAFs中抑制ERK5能夠抑制OSCC腫瘤的進(jìn)展

8、OSCC中的催產(chǎn)素對(duì)POI shift無影響

雖然OXTR CAF可以在體外以不依賴配體的方式發(fā)揮其功能，但作者希望探索OXTR配體OXT和AVP在患者中是否可能發(fā)揮作用。為了評(píng)估這一點(diǎn)，收集兩個(gè)OSCC隊(duì)列，OSCC患者的血清OXT水平隨腫瘤進(jìn)展顯著升高，而WPOI 1-3和WPOI 4-5血清中OXT和AVP水平相當(dāng)。OXT表達(dá)水平與患者生存時(shí)間無顯著關(guān)聯(lián)，且其濃度與核ERK5的活性無關(guān)。OXT和AVP水平與臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后轉(zhuǎn)移都沒有關(guān)系，都不影響CAFs的侵襲。這些結(jié)果表明，OSCC患者中WPOI型的發(fā)展與其外周血OXT/AVP水平無關(guān)。

圖8 | WPOI的疾病進(jìn)展與血清OXTR配體的表達(dá)水平無關(guān)

研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，WPOI是早期OSCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要影響因素，WPOI 4-5患者的生存時(shí)間明顯縮短，且術(shù)后出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性更高，與晚期OSCC的間充質(zhì)表型相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CAFs可能是促進(jìn)不同WPOI分型的重要因素，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OXTR通過激活核ERK5轉(zhuǎn)錄信號(hào)，以維持OXTR和CCL26高表達(dá)。ERK5敲低則會(huì)影響OXTR CAFs侵襲表型。因此，靶向OXTR CAFs中靶向ERK5信號(hào)是WPOI 4-5 OSCC患者的一種潛在的治療策略。

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