研究背景

小分子調(diào)節(jié)劑通過多種機制影響其靶蛋白，對這些生物活性分子的作用機制（MOA） 進行研究可以帶來更好的干預治療。2023年1月3日，哈佛大學醫(yī)學院Steven P. Gygi團隊在Nature Biotechnology（影響因子68.164）上發(fā)表了文章A proteome-wide atlas of drug mechanism of action，描述了875種小分子擾動劑的全蛋白質(zhì)組圖譜，并整合數(shù)據(jù)揭示了蛋白質(zhì)組中對化學擾動劑最敏感的部分，揭示了配體誘導的蛋白質(zhì)表達變化和化合物調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)靶標的規(guī)則。使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和化合物-化合物相關(guān)網(wǎng)絡來揭示了幾種化合物的作用機制。

研究思路

作者基于96孔板的高通量藥靶篩選方法，結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學在人類癌細胞系HCT116中分析了?875?種化合物，細胞與篩選化合物(10μM)、二甲基亞砜(DMSO)或陽性對照化合物一起孵育24h，然后進行裂解、胰蛋白酶消化，使用TMT11-plex標記試劑進行標記檢測。

結(jié)果展示

一、基于藥物機制的綜合蛋白質(zhì)組分析

在每種化合物影響的細胞中平均量化了8863種蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了深度蛋白質(zhì)組覆蓋。對照化合物的生物重復Pearson?相關(guān)性(r)中位數(shù)為0.87，在對兩次重復進行平均后沒有明顯的異常值，這些結(jié)果突出了這些測量的可重復性。對于免疫調(diào)節(jié)藥物(IMiD)泊馬度胺，觀察到了其已知作用機制的直接證據(jù)，通過與CRBN21形成三元復合物來降解多種蛋白質(zhì)。雖然介導IMiD在多發(fā)性骨髓瘤中的治療作用的轉(zhuǎn)錄因子IKZF1和IKZF3未在HCT116細胞中表達，但其他幾種已知的新底物，包括幾種轉(zhuǎn)錄因子被下調(diào)，重復之間的差異很?。▓D1d）。

二、蛋白質(zhì)組由小分子動態(tài)調(diào)節(jié)

這些擾動劑引起的靶標豐度變化因蛋白質(zhì)而異。由兩個標準定義蛋白質(zhì)發(fā)生的調(diào)控事件：(1)與DMSO相比的兩倍變化或?(2)?蛋白質(zhì)表達相對于所有化合物中該蛋白質(zhì)的平均變化的五個標準差變化。在此，確定了對擾動劑治療有異常頻率反應的蛋白質(zhì)只在一個方向上發(fā)生變化（圖2c）。上調(diào)的蛋白質(zhì)富含類固醇生物合成、線粒體自噬和鐵死亡途徑的成員，表明HCT116細胞通過自噬和甾醇代謝的上調(diào)來克服外源性應激源。下調(diào)的蛋白質(zhì)富含來自幾種細胞周期相關(guān)途徑的蛋白質(zhì)，包括p53信號轉(zhuǎn)導，表明這些細胞通常通過細胞周期停滯對擾動劑誘導的應激做出反應（圖2d）。根據(jù)每個調(diào)控的蛋白質(zhì)數(shù)量對化合物進行排名，發(fā)現(xiàn)最活躍的化合物調(diào)節(jié)高達25%的可觀察蛋白質(zhì)組，其中蛋白酶體抑制劑主要誘導蛋白質(zhì)上調(diào)，而轉(zhuǎn)錄抑制劑誘導蛋白質(zhì)下調(diào)。

三、靶蛋白的調(diào)控為化合物 MOA提供信息

分析研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了875種化合物中近50%注釋主要靶標，大多靶蛋白在含有目標化合物的11-plex中定量（圖3a），15%的化合物調(diào)節(jié)其靶蛋白的表達（圖3b），上調(diào)比下調(diào)更頻繁。在高活性化合物中，這些高活性化合物除了調(diào)控其靶標外，還調(diào)控許多其他蛋白質(zhì)。許多調(diào)控事件是擾動重要細胞過程的間接后果，例如基于nutin的MDM2抑制劑對其靶標的調(diào)節(jié)水平幾乎相同，這表明了機制特異性的調(diào)節(jié)閾值（圖3c）。

TNKS1/2抑制劑這兩種相關(guān)的ADP核糖基酶影響包括WNT信號傳導在內(nèi)的多種途徑。這些蛋白質(zhì)也被蛋白酶體和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑以及PARP抑制劑他拉唑帕尼上調(diào)（圖?3f）。血管動蛋白家族蛋白（AMOT、AMOTL1和AMOTL2）受TNKS通過直接相互作用和信號TNKS抑制調(diào)節(jié)，在用三種TNKS抑制劑和他拉唑帕尼處理的細胞中顯示表達增加，但在奧拉帕尼處理時沒有。這些發(fā)現(xiàn)表明，在10μM時，他拉唑帕尼（而非奧拉帕尼）對TNKS/TNKS2具有脫靶活性。最后，注意到雙特異性激酶CLK1的頻繁上調(diào)（圖2c）。整個CLK激酶家族通常在用激酶抑制劑處理的細胞中上調(diào)，CLK1和CLK4最容易上調(diào)。

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四、MOA驅(qū)動著復合群落的形成

接下來使用整個蛋白質(zhì)組指紋數(shù)據(jù)庫通過關(guān)聯(lián)所有可能的化合物對的蛋白質(zhì)組文件來生成MOA相似性網(wǎng)絡。形成了一個化合物-化合物相關(guān)網(wǎng)絡，其中包含382375個可能邊中的2543個（圖4a）。從這個網(wǎng)絡中確定了相互關(guān)聯(lián)的化合物群體，這些群體由具有重疊目標的化合物組成，其關(guān)聯(lián)反映了共享生物學（圖4b-h）。例如，一個化合物群體將MDM2和CDK4/6抑制劑歸為一組（圖4b），可能是因為這兩類都會誘導G1停滯。

幾種MAPK抑制劑形成了一個緊密的化合物群體，其中MEK抑制劑MEK162和RAF抑制劑AZ628在該組中相關(guān)性最高（圖4f，g）。最后，觀察到文庫中的三種蛋白酶體抑制劑簇（圖4h）；成對相關(guān)圖表明這些抑制劑等效地抑制蛋白酶體降解（圖4i）。這些發(fā)現(xiàn)支持復合MOA反卷積的復合-復合相關(guān)性的網(wǎng)絡級分析。

五、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相關(guān)性揭示藥物反應途徑

接下來生成了一個蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相關(guān)網(wǎng)絡，最終網(wǎng)絡（圖?5a）包含2388個節(jié)點（所有量化蛋白質(zhì)的24%）和35936條邊。在這些群落中提取更強的蛋白質(zhì)相關(guān)性揭示了包括著絲粒，其亞基NDC80-NUF2在數(shù)據(jù)集中具有最高的蛋白質(zhì)水平相關(guān)性（圖5b）。另一個化合物群體包括許多膽固醇生物合成蛋白以及幾種高度相關(guān)的自噬蛋白，TMEM59表達與溶酶體蛋白LAPTM4A的表達密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)表明需要進一步研究LAPTM4A在自噬中的作用。最后，相關(guān)網(wǎng)絡分析揭示了功能關(guān)聯(lián)。作者還定義共同調(diào)節(jié)不同蛋白質(zhì)群落的化合物家族。例如，幾種?NDUF和琥珀酸脫氫酶?(SDHA)蛋白的相關(guān)調(diào)節(jié)由大約20種化合物驅(qū)動（圖5e、f）。這些分析突出了該資源定義已知生物過程的新成員以及識別驅(qū)動感興趣的途徑和過程的藥物和工具化合物的能力。

六、擾動劑誘導的蛋白質(zhì)組指紋揭示藥物機制

觀察到SP2506、PAC-1和KH7三種沒有已知重疊靶點的相關(guān)化合物。這三種化合物具有已知的可以螯合Fe(II)等金屬陽離子的基序，相似的擾動劑的強烈相關(guān)的蛋白質(zhì)組反應表明了一種由鐵螯合驅(qū)動的共同機制，影響鐵結(jié)合蛋白和酶的功能。還發(fā)現(xiàn)了盡管表面上靶向相同的蛋白質(zhì)，但其蛋白質(zhì)組水平效應不一致的化合物。由于HCT116細胞不表達BTK，依魯替尼誘導的蛋白質(zhì)組變化很少。然而，RN486引起了顯著的蛋白質(zhì)組重塑，表明非BTK脫靶。被RN486處理上調(diào)的蛋白質(zhì)豐富了線粒體自噬、類固醇生物合成和細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路，而溶酶體在下調(diào)蛋白質(zhì)中的比例過高。自噬標記物的上調(diào)加上溶酶體蛋白的減少表明自噬失調(diào)是RN486處理細胞的主要表型，這是許多激酶抑制劑的常見機制。使用與MS偶聯(lián)的激酶親和珠進行的實驗未能發(fā)現(xiàn)RN486靶向的任何激酶，這表明非激酶脫靶介導了?RN486的作用。

七、JP1302抑制轉(zhuǎn)錄

為了測試該數(shù)據(jù)集對MOA反卷積的效用，鑒定了幾種高活性化合物，其中包括JP1302，JP1302處理誘導了與幾種RNA轉(zhuǎn)錄抑制劑相關(guān)的蛋白質(zhì)組指紋（圖6b）。這些相關(guān)化合物部分通過下調(diào)RNA聚合酶II (Pol II)磷酸化來抑制轉(zhuǎn)錄延伸。應用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相關(guān)性分析來進一步確定這組抑制劑的機制，發(fā)現(xiàn)了幾種導致p53表達增加而MDM2/p21表達減少或保持不變的化合物（圖?6c）。該分析進一步表明JP1302可能抑制RNA轉(zhuǎn)錄。比較了JP1302與THZ513誘導的蛋白質(zhì)組變化。盡管這兩種化合物同樣下調(diào)了蛋白質(zhì)表達（圖6d），但幾種下調(diào)的蛋白質(zhì)是JP1302處理所獨有的（圖?6e）。其中三個，即組蛋白亞基H2AZ1、HP1BP3和H1FX，對藥理學擾動有抵抗力（圖6f）。

為了辨別JP1302如何下調(diào)蛋白質(zhì)表達和降解組蛋白H1，再次使用細胞內(nèi)PISA，并包括一個匹配的全蛋白質(zhì)組實驗。觀察到用CDK9/12/13抑制劑黃酮吡啶治療后沒有效果，但JP1302和CBL0137都會改變許多RNA轉(zhuǎn)錄蛋白的熱穩(wěn)定性，其中FACT復合物亞基SUPT16H受影響最大（圖6h）。這些發(fā)現(xiàn)表明JP1302可作為研究FACT復合物抑制和接頭組蛋白降解的新化學工具。最后，作者通過評估幾種濃度下的PolII磷酸化和p21表達來評估JP1302作為FACT復合物抑制劑的效力。檢查了劑量依賴性蛋白質(zhì)組重塑，發(fā)現(xiàn)隨著JP1302濃度降低，處理后上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)的相對數(shù)量不同，表明通路激活存在濃度依賴性差異。

然后，將從每個濃度獲得的蛋白質(zhì)組指紋插入到化合物-化合物相關(guān)網(wǎng)絡中（圖6k）。用1μM JP1302處理的細胞與激活p53的基于nutlin的MDM2抑制劑最接近。p53敲除僅輕微影響JP1302抑制細胞增殖的能力，同時使MDM2抑制劑MI773幾乎失活，證實了該化合物的p53獨立機制。因此，JP1302動態(tài)影響細胞信號，DNA損傷在低濃度下驅(qū)動p53活性，而較高濃度導致FACT復合物破壞和RNA轉(zhuǎn)錄抑制。

總結(jié)

細胞暴露于藥物和工具化合物通常會誘導蛋白質(zhì)組重塑，該數(shù)據(jù)集可能有助于MOA闡明和藥物再利用。該資源還可以通過與離散化合物類別相對應的特定蛋白質(zhì)表達生物標志物揭示脫靶蛋白質(zhì)參與，從而揭示多藥理學。