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????????今天推薦的是由上海同仁醫(yī)院虹橋國際醫(yī)學研究院在2019年10月3日發(fā)表于Cancer Letters（2021IF：8.679，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Ying-Li Wu教授，研究表明靶向USP9x/SOX2軸有助于新藤黃酸的抗骨肉瘤作用。

研究背景

????????SOX2（SRY-related HMG-Box Gene 2）是SoxB1亞家族轉錄因子之一，對胚胎干細胞的維持、多能性和自我更新至關重要。SOX2已被視為骨肉瘤中的關鍵癌蛋白。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，誘導SOX2等轉錄因子的降解是使它們可成藥的一種很有前景的策略。

摘要部分

????????作者表明，新藤黃酸（NGA），一種大蒜的活性成分，在體外和體內(nèi)通過泛素蛋白酶體介導的SOX2降解顯著抑制了骨肉瘤細胞的增殖。作者進一步確定USP9x是SOX2的一個去泛素酶，NGA在細胞中與USP9x直接相互作用。此外，敲低USP9x抑制了骨肉瘤細胞的增殖和集落形成，這可以通過SOX2的過表達得到回補。與此相一致的是，敲低USP9x可抑制骨肉瘤細胞在異種移植小鼠模型中的增殖?？傊?，作者確定USP9x是控制SOX2穩(wěn)定性的一個去泛素化酶，而且USP9x是NGA的一個直接靶點。作者提出，針對USP9x/SOX2軸是治療骨肉瘤和其他SOX2相關癌癥的一種新策略。

研究內(nèi)容

1.NGA抑制骨肉瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡

????????為了探索NGA對骨肉瘤的抗腫瘤作用，用NGA分別處理了骨肉瘤細胞系U2OS和143B。NGA明顯抑制了腫瘤細胞的增殖。NGA處理導致U2OS和143B的caspase-3和PARP1以劑量和時間依賴的方式裂解，說明其誘導這兩種細胞發(fā)生凋亡，由Annexin V/PI染色也顯示NGA增加了凋亡細胞的百分比。此外，NGA有效地抑制了各種細胞中的集落形成。

研究結論：NGA可以抑制骨肉瘤細胞的增殖并誘導其凋亡和集落形成。

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2.SOX2的泛素化介導的降解促進了NGA的抗骨肉瘤作用? ???

????????作者發(fā)現(xiàn)NGA可以以劑量和時間依賴性方式降低SOX2的蛋白質(zhì)水平。而且蛋白酶體抑制劑 MG132 可以顯著逆轉NGA誘導的SOX2減少，說明SOX2的減少是蛋白酶依賴的。同時，NGA不會降低SOX2的 mRNA 水平但下調(diào)SOX2靶基因的表達。

????????作者隨后研究了NGA對SOX2泛素化狀態(tài)的影響。作者發(fā)現(xiàn)NGA處理可以明顯增加細胞中SOX2的泛素化，尤其是K48連接的泛素，這與蛋白酶體介導的蛋白質(zhì)降解密切相關。為了測試SOX2是否有助于NGA的抗癌作用，SOX2在 U2OS 和 143B 細胞中過表達。結果表明，SOX2的過表達顯著削弱了骨肉瘤細胞中NGA誘導的細胞死亡。

研究結論：SOX2的降解在NGA的抗骨肉瘤作用中起重要作用。

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3.NGA抑制骨肉瘤生長并減少體內(nèi)SOX2表達

????????為了進一步證明NGA在體內(nèi)的抗癌作用，作者使用了異種移植小鼠模型。與對照組相比，腹腔注射NGA顯著降低了143B細胞形成的腫瘤的大小和重量。與體外NGA對SOX2的影響一致，NGA處理也降低了體內(nèi)SOX2的表達。此外，盡管觀察到體重略有下降，小鼠仍能耐受所用濃度的NGA。

研究結論：NGA在體內(nèi)抑制骨肉瘤生長并降低SOX2表達。

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4.USP9x維持SOX2的穩(wěn)定性

????????SOX2 泛素化的增加可能是由于 E3 泛素連接酶的激活或SOX2的DUB的失活。作者推測NGA可能抑制SOX2的DUB。作者首先進行了一次篩選，在HEK 293T細胞中過度表達了30個DUBs，并通過Western blot分析了它們對內(nèi)源性SOX2蛋白水平的影響。作者發(fā)現(xiàn)，USP9x明顯上調(diào)了SOX2的蛋白水平。似乎其他一些DUBs如USP7、USP2、USP14對SOX2也有影響。然而，除了WP1130（USP9x的抑制劑）之外，一些DUBs的市售抑制劑對SOX2的表達沒有明顯影響。為了證實USP9x調(diào)節(jié)SOX2的穩(wěn)定性，USP9x在細胞中被過度表達。過量表達USP9x導致SOX2以劑量依賴的方式升高，并明顯延長了SOX2的半衰期。相反，通過shRNA敲低USP9x或通過WP1130抑制USP9x的活性可以明顯減少SOX2蛋白，但不包括其mRNA水平。此外，加入蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉SOX2的減少。

研究結論：USP9x特異性地穩(wěn)定了細胞中的SOX2。

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5.USP9x與SOX2相互作用并使其去泛素化

????????為了證明USP9x與SOX2相互作用并調(diào)節(jié)其泛素化。作者探究外源性SOX2和內(nèi)源性USP9x之間或外源性SOX2和外源性USP9x之間的相互作用。USP9x和SOX2很容易相互共免疫沉淀。另一方面，在骨肉瘤細胞中觀察到USP9x和SOX2的共定位。接下來，作者研究了USP9x是否能調(diào)節(jié)SOX2的泛素化。正如預期的那樣，敲低USP9x增加了細胞中SOX2的泛素化，而USP9x的異位表達減少了SOX2的K48-而不是K63-泛素化。

研究結論：USP9x確實調(diào)節(jié)了細胞中SOX2的泛素化

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6.NGA在細胞中與USP9x相互作用??? ?

????????已經(jīng)證明USP9x是SOX2的 DUB，作者認為NGA可以直接與細胞中的USP9x相互作用。為此，進行了CETSA測定。NGA增加了USP9x在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。此外，NGA對USP9x熱穩(wěn)定性的影響呈劑量依賴性。該數(shù)據(jù)表明NGA直接與細胞中的USP9x相互作用。

????????隨后作者進行分子對接以探索NGA與USP9x之間的結合機制。結果表明，NGA 與Ub的C端尾部可占據(jù)的相同子口袋結合結合，這與化合物WP1130不同。據(jù)報道，WP1130 通過與半胱氨酸形成可逆共價加合物來阻斷USP9x活性。殘留 Tyr 1949、Asp1685 和 Gln1796 與NGA形成極性相互作用。

研究結論：NGA的抑制機制可能是通過Ub的阻斷來實現(xiàn)的

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7.USP9x的敲低誘導骨肉瘤細胞增殖減少

????????作者已經(jīng)證明NGA可以通過直接抑制USP9x來調(diào)節(jié)SOX2的穩(wěn)定性。作者接下來試圖確定USP9x在骨肉瘤中的作用。對USP9x的敲低明顯抑制了骨肉瘤細胞的增殖。流式細胞儀分析顯示，敲低USP9x部分阻斷了G2/M期的細胞。與這些結果一致，敲低USP9x也抑制了骨肉瘤細胞的集落形成。另一方面，在USP9x敲低的細胞中重新引入SOX2可以逆轉USP9x敲低引起的對集落形成的抑制。

研究結論：USP9x在骨肉瘤細胞中發(fā)揮著致癌作用。

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8.敲低USP9x可抑制骨肉瘤細胞在體內(nèi)的增殖? ? ?

????????為了研究USP9x敲低在體內(nèi)的抗腫瘤效果，建立了一個異種移植的裸鼠模型，皮下接種USP9x敲低的143B細胞。與對照組相比，USP9x的敲低明顯減少了腫瘤的大小和重量。與對照組相比，免疫組織化學檢測顯示，USP9x沉默組有較高的凋亡細胞百分比，較低的增殖細胞百分比和較低的SOX2蛋白水平。

研究結論：敲低USP9x后，體內(nèi)的SOX2減少，抑制了骨肉瘤細胞的增殖。

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結論與討論

????????綜上所述，作者證明了USP9x可以在骨肉瘤細胞中去泛素化并穩(wěn)定SOX2，并且USP9x是治療骨肉瘤的一個新的治療靶點。NGA是一種新的有前景的USP9x抑制劑，可用于治療骨肉瘤。由于SOX2參與調(diào)控胚胎干細胞和其他癌癥干細胞, USP9x/SOX2軸的發(fā)現(xiàn)可能比骨肉瘤治療有更重要的意義。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.10.015