●?前言

2021年12月30日復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所周虎研究員、中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心高大明研究員、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院高強(qiáng)教授課題組合作在Cancer Cell上發(fā)表題為“Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究論文，通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物組學(xué)研究方法對(duì)262例肝內(nèi)膽管癌（iCCA）患者的配對(duì)腫瘤和癌旁組織進(jìn)行了分析，通過(guò)繪制肝內(nèi)膽管癌的多維分子圖譜為進(jìn)一步鑒定iCCA的分子發(fā)病機(jī)制、分子分型、預(yù)后等提供了寶貴的資源。

中文標(biāo)題：蛋白基因組學(xué)特征確定肝內(nèi)膽管癌的臨床亞型

研究對(duì)象：肝內(nèi)膽管癌

發(fā)表期刊：Cancer Cell

影響因子：31.743

發(fā)表時(shí)間：2021年12月30日

運(yùn)用生物技術(shù)：基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物組學(xué)

●?研究背景

肝內(nèi)膽管癌(iCCA)是常見(jiàn)的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤。多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，且治療效果有限。因此迫切需要更深入地了解肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病機(jī)制以鑒定可能的治療靶點(diǎn)。本文在國(guó)際癌癥蛋白質(zhì)基因組聯(lián)盟（ICPC）的主持下，對(duì)262名中國(guó)iCCA患者進(jìn)行了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和微生物組學(xué)分析，為進(jìn)一步的生理病理研究、疾病診斷和藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

●?研究思路

●?研究結(jié)果

1.?中國(guó)iCCA患者的蛋白質(zhì)基因組全景

為了描述中國(guó)iCCA患者的蛋白質(zhì)基因組特征，作者收集了262個(gè)來(lái)自前瞻性隊(duì)列的未接受治療的iCCA患者腫瘤和配對(duì)癌旁組織（FU-iCCA）。共鑒定了12,197個(gè)非同義體細(xì)胞點(diǎn)突變和603個(gè)插入缺失。蛋白質(zhì)組定量到了10,529種蛋白質(zhì)，磷酸化蛋白質(zhì)組定量到了來(lái)自9,832個(gè)磷酸化蛋白的62,879個(gè)磷酸化位點(diǎn)?；蚪M確定了包括TP53、KRAS、FGFR2、IDH1/2、BAP1、ARID1A和PBRM1在內(nèi)的16個(gè)顯著改變的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因（圖1A）。與西方iCCA人群隊(duì)列相比，本文隊(duì)列顯示出更高的KRAS突變頻率和更低的IDH1、ARID1A和TERT突變頻率（圖1B）。在FU-iCCA隊(duì)列中觀察到黃曲霉毒素和馬兜鈴酸特征（圖1C）。通過(guò)比較具有或不具有黃曲霉毒素特征的所有腫瘤的多組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)具有黃曲霉毒素特征的腫瘤顯示出DNA修復(fù)和細(xì)胞周期通路的上調(diào)以及細(xì)胞凋亡、感染炎癥和免疫通路的下調(diào)（圖1E）。進(jìn)一步分析顯示，TP53突變與黃曲霉毒素特征顯著相關(guān)（圖1F和1G）。

圖1 | FU-iCCA隊(duì)列的基因組圖譜

2.體細(xì)胞拷貝數(shù)改變的多組學(xué)分析

總共有39.3%（101/253）的FU-iCCA存在至少一種基因改變，其中包含61例突變，9例TMB高，32例融合和4例擴(kuò)增。這些拷貝數(shù)改變(CNAs)對(duì)mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白豐度具有順式和反式影響（圖2A）。對(duì)于mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白，總共觀察到3,981、1,081和408個(gè)顯著的順式相關(guān)性，3個(gè)組學(xué)中只有194個(gè)共同的顯著順式影響（圖2B）?？偣灿?63種蛋白質(zhì)同時(shí)表現(xiàn)出CNA-mRNA和CNA-蛋白質(zhì)順式效應(yīng)，它們主要富集在代謝、生物合成和蛋白質(zhì)加工通路中（圖2C）。值得注意的是，14q丟失顯示出與蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組豐度的不同相關(guān)性（圖2E），表明這些區(qū)域存在潛在的蛋白質(zhì)水平調(diào)節(jié)。對(duì)于蛋白質(zhì)豐度隨著14q丟失而增加的585個(gè)基因，富集到了剪接體、錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和代謝的通路（圖2F）。此外，14q丟失分別顯示對(duì)蛋白酶體基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子的蛋白表達(dá)水平的順式和反式影響（圖2G）?？偠灾?strong>14q丟失相關(guān)的全局順式和反式相關(guān)性可能為iCCA腫瘤發(fā)生提供機(jī)制基礎(chǔ)（圖2H）。

圖2 | 拷貝數(shù)改變對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)豐度的影響

3.體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)突變的蛋白基因組關(guān)聯(lián)分析

作者分析了體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)突變對(duì)蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白豐度的影響，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)最顯著的驅(qū)動(dòng)突變（TP53、KRAS、IDH1/2和BAP1）。TP53突變與細(xì)胞周期、藥物代謝、吞噬體和碳代謝通路的上調(diào)以及ECM-粘著斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信號(hào)通路的下調(diào)有關(guān)（圖3A)。KRAS突變與炎癥感染和ECM-粘著斑通路中蛋白質(zhì)的增加以及細(xì)胞周期通路中的蛋白質(zhì)減少有關(guān)（圖3B）。有趣的是，本文隊(duì)列中有10例iCCA患者攜帶TP53和KRAS共突變，其生存率明顯低于TP53或KRAS單突變患者（圖3C）。與TP53、KRAS單突變或不突變相比，TP53或KRAS雙突變的腫瘤中細(xì)胞粘附相關(guān)分子高表達(dá)（圖3D和3E）。進(jìn)一步分析表明，ECM和膽汁分泌通路在BAP1突變腫瘤和IDH1/2突變腫瘤中都相互激活，而吞噬體、炎癥和MAPK通路僅在它們中的其中一個(gè)相對(duì)活躍（圖3G、3H）。

圖3 |?驅(qū)動(dòng)突變對(duì)蛋白基因組的影響

4.與FGFR2改變和KRAS突變相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)組變化

iCCA中增強(qiáng)的FGFR2信號(hào)傳導(dǎo)由突變和染色體易位介導(dǎo)。本文結(jié)果表明所有FGFR2突變都位于激酶域之外（圖4A）。在11.9%的FU-iCCA中發(fā)現(xiàn)的FGFR2融合主要是由含有二聚化結(jié)構(gòu)域的融合配偶體產(chǎn)生的，以誘導(dǎo)配體非依賴性受體二聚化。這些融合通過(guò)熒光原位雜交進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4C），幾乎所有具有FGFR2融合的腫瘤細(xì)胞都顯示出分離的探針信號(hào)，表明FGFR2融合是iCCA中的早期克隆事件。由于FGFR2改變和KRAS突變可能影響MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Rho GTPase通路，作者探索了有無(wú)這些改變的腫瘤中磷酸化位點(diǎn)和蛋白豐度的區(qū)別（圖4D）。KRAS突變的腫瘤顯示出MAPK通路的級(jí)聯(lián)激活。而Rho GTPase通路在FGFR2改變的腫瘤中顯著上調(diào)（圖4E）。此外，FGFR2改變的腫瘤在PTPN11的Y62和TLN1的Y70位點(diǎn)上顯示出顯著的酪氨酸磷酸化(圖4F)。熱圖顯示FGFR2和PTPN11蛋白以及PTPN11 Y62磷酸化同時(shí)上調(diào)（圖4G）。

圖4 | FGFR2改變和KRAS突變對(duì)蛋白基因組的影響

5.鑒定源自FGFR2::BICC1融合的潛在新表位和相應(yīng)的T細(xì)胞反應(yīng)

基因融合可以產(chǎn)生用于個(gè)性化免疫治療的新肽候選物。對(duì)于FGFR2::BICC1融合蛋白，使用跨越斷點(diǎn)殘基的序列(DLDRILTLTTNEIMEETNTQI和DLDRILTLTTNEGSSMSLSRS)構(gòu)建序列數(shù)據(jù)庫(kù)(圖5A)。通過(guò)四聚體交換測(cè)定，一部分合成肽成功地交換到HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚體（圖5B）。來(lái)自健康供體的T細(xì)胞可能提供豐富的T細(xì)胞庫(kù)，可以特異性識(shí)別腫瘤上呈現(xiàn)的新抗原。來(lái)自三個(gè)健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)與上述融合肽共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)供體1和2的PBMC與肽32和33共培養(yǎng)時(shí)IFN-g分泌顯著上調(diào)（圖5B）。接下來(lái)，使用肽32和33刺激來(lái)自供體1和2的PBMC 7天，然后通過(guò)CyTOF和TCR測(cè)序。CyTOF數(shù)據(jù)顯示，T細(xì)胞的表型隨著肽刺激而進(jìn)化（圖5C）。偽時(shí)間分析顯示，T細(xì)胞向激活發(fā)展，然后分叉成memory和exhausted的分支，代表成熟后期的兩個(gè)譜系（圖5D）。Morisita-Horn指數(shù)（圖 5E）證實(shí)了供體2中肽32刺激后TCR庫(kù)的重排（圖5F)。盡管供體間存在異質(zhì)性，但新表位T細(xì)胞反應(yīng)性的低頻率代表了克服iCCA融合患者的免疫編輯和耐藥性的寶貴外部資源。

圖5|大黃素抑制 SAP 期間胰腺外泌體的分泌

鑒定源自FGFR2:BICC1融合的潛在新表位及其新表位反應(yīng)性T細(xì)胞表型

6.具有不同生物學(xué)和臨床特征的蛋白質(zhì)組亞群

作者使用變化最大的1,376種蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類（圖6A），鑒定了4個(gè)不同的蛋白質(zhì)組亞型（S1-S4），這些亞型具有不同的臨床、基因組、免疫學(xué)和微環(huán)境特征。S1展現(xiàn)出豐富的炎癥蛋白表現(xiàn)，例如CD14、MPO和C5AR1。S2具有最高水平的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞和ECM相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括FAP、POSTN和FLT1。S3的特點(diǎn)是MAPK和代謝蛋白升高，例如ACAT1、FASN和IDH1。S4保留了粘附和膽道特異性蛋白的最大表達(dá)，例如ANXA4、KRT18和EPCAM（圖6B）。

臨床指標(biāo)中，S1亞型患者CA19-9、腫瘤壞死和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移水平升高。S2亞型患者有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。S3亞型患者以HBV感染為特征。S4亞型富集了低水平CA19-9和較少轉(zhuǎn)移的患者。四個(gè)蛋白質(zhì)組亞型的總生存期(OS)存在顯著差異，S1-S4的中位生存期分別為17.2、25.3、36.7和>60個(gè)月（圖6C）。多因素Cox分析證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)亞型是獨(dú)立預(yù)后因子。重要的是，對(duì)于TNM早期階段的患者，蛋白質(zhì)組學(xué)亞型同樣可以對(duì)患者的生存率進(jìn)行分層（獨(dú)立于CA19-9和CEA水平）（圖6C）。此外，作者發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)組學(xué)亞型與之前報(bào)道的膽管癌分子亞型之間存在相當(dāng)?shù)闹丿B[1]。

每個(gè)亞型顯示出反復(fù)改變基因的不同圖譜（圖6D）。KRAS突變?cè)赟1中顯著富集，同時(shí)炎癥通路上調(diào)。TP53突變?cè)赟3中占主導(dǎo)地位，伴隨著富集的細(xì)胞周期和MAPK信號(hào)通路。FGFR2改變、BAP1突變和IDH1/2突變?cè)赟4中最常見(jiàn)，部分與膽汁分泌升高一致?；趚Cell分析，S1以中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀、Th2和Treg浸潤(rùn)為主，其中大部分可能與免疫抑制有關(guān)（圖6E）。S2顯示出最高強(qiáng)度的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)評(píng)分和血管生成評(píng)分增加。S4具有最豐富的嗜堿性粒細(xì)胞和CD8+ naive T細(xì)胞。免疫檢查點(diǎn)也表現(xiàn)出亞型特異性模式，S1中IDO、CEACAM1、CD47、VSIG4和CD274升高，S2中CD276、CD40和NT5E升高，S4中VTCN1、HMGB1和PVRL2升高，顯示出通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分層獲得潛在的免疫治療益處。

作者從四個(gè)亞型中篩選了各自的特異性標(biāo)志物，分別是MPO（中性粒細(xì)胞）、POSTN（成纖維細(xì)胞）、ALDOB（代謝）和EPCAM（膽管）（圖6F）。在FU-iCCA隊(duì)列(n = 84)和驗(yàn)證隊(duì)列(n = 144)中，4種標(biāo)志物的多重免疫染色可以對(duì)患者生存進(jìn)行分層（圖6G）。此外通過(guò)mRNA和磷酸化蛋白的聚類，作者分別鑒定了三個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞型和三個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)組亞型，不同亞型間的患者具有顯著的預(yù)后差異。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)亞型與蛋白質(zhì)組亞型有部分重疊，具有不同的分子特征。

接著作者分析了15個(gè)iCCA細(xì)胞系的蛋白基因組，發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞系與S1一致，5個(gè)與S2一致，4個(gè)與S3一致，3個(gè)與S4一致。對(duì)其中的10種細(xì)胞系進(jìn)行高通量藥物篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞系對(duì)一線鉑類藥物普遍耐藥，而吉西他濱和紫杉醇對(duì)S1和S3除外的大多數(shù)細(xì)胞系敏感。拓?fù)洚悩?gòu)酶I/II抑制劑和微管相關(guān)抑制劑對(duì)所有亞型都廣譜抗iCCA活性。此外，S1和S2對(duì)EGFR抑制劑的敏感性高于S3和S4。這些數(shù)據(jù)表明不同的亞型患者具有不同的藥物反應(yīng)，可能需要針對(duì)亞型的治療。

圖6 | FU-iCCA隊(duì)列的蛋白質(zhì)組學(xué)分層和相應(yīng)的分子和通路特征

7.鑒定和驗(yàn)證蛋白質(zhì)組預(yù)后標(biāo)志物

作者通過(guò)監(jiān)督分析鑒定了19種良好預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)和15種不良預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)（圖7A）。其中，HKDC1是最顯著的預(yù)后正相關(guān)蛋白，SLC16A3是最顯著的預(yù)后負(fù)相關(guān)蛋白（圖7B）。這兩種蛋白的豐度在四個(gè)蛋白質(zhì)組亞型中也存在顯著差異，SLC16A3在S1中上調(diào)，HKDC1在S4中升高（圖7C)。

在另一個(gè)獨(dú)立的iCCA隊(duì)列（圖7D，n = 222）中，免疫染色結(jié)果表明HKDC1低表達(dá)和SLC16A3的高表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后，進(jìn)一步確認(rèn)了其預(yù)后價(jià)值。本文數(shù)據(jù)表明HKDC1可能在iCCA中充當(dāng)腫瘤抑制因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HKDC1的過(guò)表達(dá)降低了HuCCT1細(xì)胞的細(xì)胞增殖、集落形成、葡萄糖消耗和糖酵解能力，支持其在iCCA細(xì)胞中的抗糖酵解/增殖作用（圖7E、7G）。而過(guò)表達(dá)SLC16A3的HuCCT1細(xì)胞表現(xiàn)出更快的增殖和更高的集落形成（圖7F），這可能是由于更有效的糖酵解能力（圖7H）。SLC16A3敲低顯著降低了HuCCT1細(xì)胞增殖、集落形成和糖酵解能力。因此，SLC16A3主要通過(guò)促進(jìn)糖酵解代謝在iCCA中發(fā)揮致癌因子的作用。

圖7 | 鑒定和驗(yàn)證蛋白質(zhì)組預(yù)后標(biāo)志物

8.整合微生物組和蛋白基因組

為了研究iCCA組織細(xì)菌與癌癥進(jìn)展之間的潛在關(guān)系，作者從4個(gè)蛋白質(zhì)組亞型中隨機(jī)且均等地選擇了80對(duì)iCCA腫瘤和癌旁樣本，并進(jìn)行了16S rRNA測(cè)序。腫瘤微生物α多樣性分析顯示α多樣性從S1到S4呈下降趨勢(shì)。然而，腫瘤和癌旁組織之間的微生物α多樣性沒(méi)有顯著差異。進(jìn)一步的分析表明，腫瘤微生物群落在每個(gè)亞型中呈現(xiàn)出系統(tǒng)發(fā)育接近性。在4個(gè)亞型中，共有12個(gè)屬具有豐度上的差異。因此，四個(gè)蛋白質(zhì)組亞型具有不同的腫瘤微生物群多樣性、組成和功能，可能在免疫和代謝重塑中發(fā)揮重要作用。

● 研究結(jié)論

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和微生物組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析鑒定了分子機(jī)制和疾病亞型，這些信息單獨(dú)從基因組和轉(zhuǎn)錄組是無(wú)法完全捕獲的。本文數(shù)據(jù)可能為開(kāi)發(fā)個(gè)性化靶向藥物和免疫療法開(kāi)辟新途徑，為深入研究iCCA的致癌、進(jìn)展和治療提供寶貴資源。

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隨著美國(guó)臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析項(xiàng)目（CPTAC）和中國(guó)人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃(CNHPP)等大型蛋白質(zhì)組學(xué)研究計(jì)劃的推進(jìn)，發(fā)表了一系列腫瘤的大規(guī)模人群多組學(xué)分析文章[2,3]。這些高分文章通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、微生物組學(xué)等技術(shù)，在上百例的病例樣本中全面表征了某種腫瘤的分子特征。對(duì)比這些文章，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)在多組學(xué)數(shù)據(jù)分析中逐漸成為核心結(jié)果，且蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析有些共同特點(diǎn)，即：

1）?基于蛋白質(zhì)組進(jìn)行腫瘤分子分型

2）?分析不同亞型患者的臨床特征

3）?免疫、代謝、突變、微生物等腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)在不同亞型中的差別分析

4）?篩選亞型特征分子作為預(yù)后標(biāo)志物或潛在的藥靶進(jìn)行驗(yàn)證或機(jī)制研究

該文是樊嘉院士/周虎研究員/高大明研究員/高強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)繼2019年Cell發(fā)表的肝細(xì)胞癌多組學(xué)研究后，同樣基于蛋白質(zhì)組為核心的多組學(xué)聯(lián)合分析策略，進(jìn)一步闡釋了蛋白質(zhì)組學(xué)驅(qū)動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、分子分型、預(yù)后監(jiān)測(cè)和個(gè)性化治療策略提供新思路。

參考文獻(xiàn) （選填）

[1] Job, S., Rapoud, D., Dos Santos, A., Gonzalez, P., Desterke, C., Pascal, G.,?Elarouci, N., Ayadi, M., Adam, R., Azoulay, D., et al. (2019). Identification of?four immune subtypes characterized by distinct composition and functions?of tumor microenvironment in intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology?72, 965–981.

[2] Jiang, Y., Sun, A., Zhao, Y., Ying, W., Sun, H., Yang, X., Xing, B., Sun, W., Ren,?L., Hu, B., et al. (2019). Proteomics identifies new therapeutic targets of early stage?hepatocellular carcinoma. Nature 567, 257–261.

[3] Gao, Q., Zhu, H., Dong, L., Shi, W., Chen, R., Song, Z., Huang, C., Li, J., Dong,?X., Zhou, Y., et al. (2019). Integrated proteogenomic characterization of HBV-related?hepatocellular carcinoma. Cell 179, 561–577.e22.

文末看點(diǎn) | lumingbio

鹿明生物一直專注于生命科學(xué)和生命技術(shù)領(lǐng)域，是國(guó)內(nèi)早期開(kāi)展蛋白質(zhì)組研究的團(tuán)隊(duì)，特別是tims?TOF Pro?4D蛋白質(zhì)組質(zhì)譜平臺(tái)的引進(jìn)，大幅提高的質(zhì)譜平臺(tái)的性能，更高的重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏度，以及更快的掃描速度為大隊(duì)列研究提供了堅(jiān)實(shí)的保障。

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