原理：

1. 多糖的提取方法

生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、動物多糖 3 大類。 多糖的提取首先要根據(jù)多糖的

存在形式及提取部位，決定在提取之前是否做預(yù)處理。 動物多糖和微生物多糖多有脂質(zhì)包圍，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進行回流脫脂，釋放多糖。 植物多糖提取時需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在提取前，應(yīng)先用低極性的有機溶劑對原料進行脫脂預(yù)處理，目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法、生物提取法、強化提取法等。

1.1 溶劑法

①水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。 多糖是極性大分子化合物，提取時應(yīng)選擇水、醇等極性強的溶劑。 用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分數(shù)達到 70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置 5 h，多糖的質(zhì)量分數(shù)和得率均較高。 影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數(shù)等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時，提取率也不高。

②酸提法

③堿提法?

④ 超臨界流體萃取法

1.2 酶解法

①單一酶解法?

②復(fù)合酶解法

1.3 物理強化法

①微波輔助提取法

②超聲波輔助提取法

超聲波提取是利用超聲波的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)。 機械效應(yīng)可增大介質(zhì)的運動速度及穿透力，能有效的破碎生物細胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中；空化效應(yīng)使整個生物體破裂，整個破裂過程在瞬間完成，有利于有效成分的溶出；熱效應(yīng)增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應(yīng)是瞬間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變；此外，許多次級效應(yīng)也能促進提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。超聲波提取與水煮法醇沉法相比，萃取充分，提取時間短；與浸泡法相比，提取率高。

③高壓脈沖法

2. 多糖的分離純化

2.1 除蛋白

①Sevage 法

根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變性的特點，用 V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為 5∶1 或 4∶1，混合物劇烈振搖 20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。 此種只能除去少量蛋白質(zhì)，效率不高，須反復(fù)多次，多糖有損失。 但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，用 Sevage 法效果更佳。 此法不能除去脂蛋白，因為脂蛋白溶于氯仿。

②三氟三氯乙烷法 ③三氯乙酸法

2.2 多糖的分離

①分級沉淀法

大多數(shù)活性多糖可溶于水，3 個碳以下的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐漸降低。根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐漸增加，從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。

②季銨鹽沉淀法

黏多糖與一些陽離子表面活性劑（如 CTAB）可以結(jié)合形成季銨鹽絡(luò)合物，這些絡(luò)合物在低離子強度溶液中不溶，在高離子強度溶液中會發(fā)生解離，二次醇沉后可提高產(chǎn)物中黏多糖的含量。

③色譜分離

?④膜分離法

3 多糖的分析鑒定

①含量的測定

測定方法：硫酸－苯酚法、蒽酮－硫酸法（總糖）、DNS 法（還原法）、離子交換色譜法、HPLC 法、凝膠電泳法、親和電泳法、次亞碘酸鹽定量法、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對某些多糖的測量效果好。比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時用于多糖的定性定量分析。蒽酮法測定可溶性糖含量的原理： 糖類在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫水生成糠醛或羥甲基糖醛后，與蒽酮(C14H10O)脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色。該物質(zhì)在 620 nm 處有最大吸收，在 150 μg/mL 范圍內(nèi)，其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度，糖含量在 30 μg 左右就能進行測定，所以可做為微量測糖之用。一般樣品少的情況下，采用這一方法比較合適。

②純度鑒定

多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。 多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC 法等。 現(xiàn)在應(yīng)用較多的是 HLPC 法，旋光度測定也是純度測定的一種方法。

③分子量的測定?

④結(jié)構(gòu)測定

試劑：

1. 銀耳

2. 1% CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）

3. 無水乙醇

4. 1mol/L CaCl2

5. 葡萄糖標準液：0.1 mg/mL

6. 蒽酮試劑：0.2 g 蒽酮溶于 100 mL 濃 H2SO4 中。當日配制使用。

實驗步驟：

1. 原料干燥稱重，每10g 加入 800mL 水，沸水浴超聲加熱 8h，紗布過濾收集清液。

2. 加入 1/4 體積氯仿-正丁醇溶液，搖勻，3000rpm 離心 10min，小心收集上清液（無氯仿，省略）

3. 加入 3 倍體積 95%乙醇，攪拌均勻，4 ℃ 3000rpm 離心 5min（或直接用玻璃棒攪拌收集絮狀多糖），無水乙醇洗滌沉淀 1 次，至于稱過重量的表面皿上干燥。

4.收集銀耳多糖粗品，干燥稱重。計算粗品得率=（總質(zhì)量-表面皿質(zhì)量）/（初始體積*10/800）

5. 取粗品，稱量后配置成 1%水溶液，小心倒出上清，去除不溶物，吸取1mL備用，其余上清液加 1/5體積 1%CTAB，沉淀完全，搖勻靜置 30min，3000rpm 離心 5min 收集沉淀

6. 沉淀加入 20 mL 1mol/L CaCl2，解離2-3h，3000rpm 離心 10min 收集上清

7. 上清中加入 3 倍體積乙醇，攪拌均勻，4 ℃ 3000rpm 離心 5min（或直接用玻璃棒攪拌收集

絮狀多糖），無水乙醇洗滌沉淀1次，至于稱過重量的表面皿上干燥。干燥得銀耳多糖精品，計算回收率=（總質(zhì)量-表面皿質(zhì)量）/粗品多糖質(zhì)量

8. 純度測定（根據(jù)情況選做）蒽酮法測定總糖含量，計算獲得多糖含量

1）葡萄糖標準曲線的制作

取 7 支大試管，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液：

在每支試管中立即加入蒽酮試劑 4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸 l0 min 取出，用冰浴冷卻至室溫，在 620 nm波長下以第一管為空白，迅速測其余各管吸光值。以標準葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，以吸光值為縱坐標，作出標準曲線。

2）樣品中可溶性糖的提?。?/p>

將樣品 105 oC 烘干至恒重，精確稱取 0.1 g，加水 100mL（1 mg/mL） ，或者將之前備用的1%多糖稀釋十倍

3）稀釋：吸取上一步糖液 1 mL，加水19 mL（0.05 mg/mL），以蒸餾水稀釋定容，搖勻。

4）測定

吸取 1 mL 已稀釋的提取液于試管中，加入 4.0 mL 蒽酮試劑；以等量蒸餾水取代糖液作為空白對照。以下操作同標準曲線制作。根據(jù) OD620 平均值在標準曲線上查出葡萄糖的濃度（mg/mL）。

9.計算純度