A novel cuproptosis-related prognostic 2-lncRNAs signature in breast cancer

銅死亡lncRNAs的篩選

我們從 TCGA 數(shù)據(jù)集中獲得了 1,109 個乳腺癌樣本和 103 個相鄰樣本的表達。共篩選出13493個lncRNA。將通過 Wilcox 檢驗獲得的在乳腺癌和鄰近樣本中差異表達的 lncRNA 納入后續(xù)分析 (?p?< .05)。我們通過相關性檢驗確定了與銅凋亡相關的 lncRNA。Pearson 相關分析表明，153 個 lncRNA 與乳腺癌中的銅細胞凋亡相關基因相關（Cor <.3，p值 <.05）。Sankey圖譜顯示了7個Cuproptosis相關基因與153個Cuproptosis相關lncRNAs的對應關系

分組

將TCGA乳腺癌患者的數(shù)據(jù)按1:1的比例隨機分為訓練集和內(nèi)部驗證集?？ǚ綑z驗驗證了分組的公平性。Test和Train之間所有指標的卡方檢驗p值均>.05，說明分組的公平性。

銅凋亡相關lncRNA模型的建立

通過使用單變量 cox 回歸分析 (?p?< .05)，我們從訓練數(shù)據(jù)集中的 153 個銅細胞凋亡相關 lncRNA 中識別出 5 個與患者 OS 高度相關的 lncRNA.?然后Lasso分析篩選出兩個相對權重最大的基因（USP2-AS1、NIFK-AS1）用于后續(xù)模型構建（.?還提供了套索分析的偏似然偏差.?接下來，我們使用多變量 COX 回歸來擬合乳腺癌患者的銅細胞凋亡相關 lncRNA 風險模型 (BCCuS)。預后風險評分公式：BCCuS = (1.117,558 × USP2-AS1)+(?1.05486 × NIFK-AS1) (表 2).?根據(jù)中位 BCCuS 評分，將訓練數(shù)據(jù)集中的 1,109 名乳腺癌患者分為兩組：高 BCCuS 組和低 BCCuS 組，我們可以知道lncRNA USP2-AS1是乳腺癌患者的有利預后因素，lncRNA NIFK-AS1是乳腺癌患者的不利預后因素。

BCCuS 在乳腺癌中的驗證

根據(jù)TCGA樣本的表達數(shù)據(jù)，相關熱圖顯示了用于構建模型的2個lncRNA與7個銅凋亡基因的表達相關性.?USP2-AS1與四種基因（DLAT、PDHA1、FDX1、DLD）呈正相關，與兩種基因（LIAS、PDHB）呈負相關。NIFK-AS1 與三個基因（LIAS、LIPT1、PDHB）呈正相關，與兩個基因（DLD、DLAT）呈負相關（.?為了進一步評估 BCCuS 在乳腺癌中的預測能力，基于從 TCGA 網(wǎng)站獲得的患者 OS（總體生存）數(shù)據(jù)和患者 PFS，在 TCGA 數(shù)據(jù)集的訓練隊列和內(nèi)部驗證集中進行了 Kaplan Meier 生存分析（ pronossion free survival) 從 XENA 網(wǎng)站 (?https://xena.ucsc.edu/?) 獲得的數(shù)據(jù)。在 train set 中，結果顯示高風險組乳腺癌患者的 OS 比低風險組差 (?p?= .026) 并且 PFS 也比低風險組差 (?p?< .001)?在內(nèi)部驗證集中，高風險組乳腺癌患者的 OS 低于低風險組 (?p?= .033)以及 PFS (?p?= .012) .?在所有 TCGA-BRCA 1109 樣本中，高風險組乳腺癌患者的 OS 比低風險組差 (?p?= .001)，以及 PFS (?p?= .024) .?構建單變量和多變量 Cox 回歸來評估預后特征是否獨立于年齡、性別、臨床分期和 TNM 分期（.?結果表明，BCCuS可能是一個獨立的預后因素，可以部分消除臨床因素的干擾。使用 R 包“熱圖”繪制風險圖，在兩組中，USP2-AS1 似乎在 BCCuS-high 組中表達更高，NIFK-AS1 在 BCCuS-low 組中表達更高，這表明模型基因的可靠性.?使用 c 進一步驗證風險模型以檢查預測效率，AUC（曲線下面積）：1 年：0.730，3 年：0.677，5 年：0.610?ROC 曲線包含 BCCuS，其他臨床因素顯示 BCCuS 是比臨床分期更好的預測特征（BCCuS AUC = .730，分期 AUC = .717）?BCCuS 與其他臨床信息的一致性指標表明 BCCuS 可以作為可靠的臨床參考指標.?列線圖是基于臨床方便預測單例患者預后的評分構建的?此外，在根據(jù)臨床分期（第 1-2 期： p?= .024；第 3-4 期：p?= .003）和年齡（≤60：p?= .005?）對所有樣本進行分組后，繪制了 KM ?>60:?p?= .011)?

模型相關生物學機制

首先，我們使用 limma 包分析了 BCCuS-high 和 BCCuS-low 組之間差異表達的基因 (?p?< .001, |log2Foldchange|>1).?篩選出26個差異基因，用火山圖展示。在這26個基因中，18個基因下調(diào)，8個基因上調(diào)，包括鈣結合蛋白S100A8和S100A9。S100A8/A9 在腫瘤微環(huán)境和外部環(huán)境中均有表達，可歸類為腫瘤發(fā)生過程中的信號（Moon 等人，2008 年；Woo 等人，2021 年）。GO富集分析顯示，差異表達基因富集了代謝代謝相關的分子功能和免疫反應（Ashburner et al., 2000），如金屬離子螯合和白細胞遷移.?KEGG 結果表明，BCCuS-high 和 BCCuS-low 組在與免疫反應和能量代謝相關的途徑中存在差異富集，例如血清素能突觸和病毒蛋白與細胞因子受體的相互作用

BCCuS與免疫功能的關系

我們使用 R 包“GSVA”來計算高風險組和低風險組之間免疫功能富集的顯著差異。只有 II 型干擾素反應在 BCCuS 高組中受到顯著抑制。HLA、T 細胞共抑制、檢查點、APC 共刺激、CCR、APC 共抑制、Para 炎癥、MHC I 類和 I 型 IFN 反應均在 BCCuS 高組中得到顯著促進 ( p < .05?)腫瘤免疫功能障礙評分（TIDE）符合腫瘤免疫逃逸特征，可以預測免疫抑制治療的效果（Jiang et al., 2018）。BCCuS-high 組 TIDE 評分顯著降低，這可能揭示了腫瘤細胞的免疫逃逸并可能導致預后不良

模型得分與突變之間的關系

根據(jù)中位風險評分，將 1,109 份乳腺癌樣本分為高組和低組。使用“maftools”R 包計算兩組中的突變頻率和 TMB。在BCCuS-low組中，PIK3CA、CDH1、MAP3K1的突變頻率上調(diào)，這些基因被報道為乳腺癌的抑癌基因而 TP53 和 TTN，在 BCCuS 高組中被上調(diào)，作為乳腺癌的啟動子發(fā)揮作用從 TCGA 數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌樣本的 TMB（腫瘤突變負荷）數(shù)據(jù)和堿基突變數(shù)據(jù)。KM 圖繪制在 TMB 高和 TMB 低組之間，TMB 高顯示較低的生存概率 (?p?= .023)然后根據(jù)BCCuS和TMB，將TCGA樣本分為四組，擬合生存曲線。BCCuS 高和 TMB 高組顯示出最高風險 (?p?= .005) 小提琴圖顯示高危人群與較高的 TMB 關系密切

BCCuS敏感抗癌藥物的機器學習篩選

通過使用pRRhetic包和機器學習(篩選出36種敏感性(IC50)與模型顯著相關的抗癌藥物。p值的閾值設置為 .001。值得注意的是，順鉑、馬賽替尼、吉非替尼、替伏扎尼等多種腫瘤化療藥物和靶向藥物在高危人群中敏感性更高36種抗癌藥中，31種在高BCCuS組敏感性較高，5種在高BCCuS組敏感性較低。

通過 qPCR 進行實驗驗證

對來自 10 名乳腺癌患者的原發(fā)性乳腺癌組織和癌旁正常組織進行了 qPCR。結果表明，兩種模型 lncRNA 在癌癥和 Para 癌樣本中均有差異表達，USP2-AS1 和 NIFK-AS1 在癌癥樣本中的表達均較低。FDX1、PDHA1 和 DLAT 在乳腺癌中也顯著下調(diào)。使用實驗表達構建了七個銅凋亡相關基因和兩個模型 lncRNA 的相關熱圖。結果顯示USP2-AS1的實驗表達與PDHA1呈正相關，NIFK-AS1與LIPT1呈正相關，這與之前的生物信息學預測一致。