怎么檢測(cè)慢病毒滴度？請(qǐng)收下這份protocol~
慢病毒滴度檢測(cè)采用稀釋計(jì)數(shù)測(cè)定法
滴度單位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。“TU”為“transducing units”的縮寫(xiě)，中文為“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。
I. 細(xì)胞準(zhǔn)備
????將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至 1x10^5/mL, 加入96孔板，100 μL/孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備6個(gè)孔。放入37°C ，5 % CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
II. 加病毒
?第二天，準(zhǔn)備6個(gè)1.5 mL EP管，第一個(gè)EP管中加入10 μL病毒原液，然后做3倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。
III. 追加培養(yǎng)液
?第三天，有需要加puromycin篩選的孔，先吸去100 μL含病毒培養(yǎng)基，加入100 μL 含1.5 μg/mL puromycin的10 % FBS完全培養(yǎng)基。
IV. 觀察結(jié)果并計(jì)算滴度
?第五天，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，在觀察結(jié)果前6 h需更換新鮮10 % FBS完全培養(yǎng)基，從孔中吸出80 μL培養(yǎng)基，然后加入80 μL新鮮10 % FBS完全培養(yǎng)基，放入37°C ，5 % CO2 ?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，熒光或活細(xì)胞百分比在10~50 % 的孔計(jì)算病毒滴度。
滴度（TU/mL）= 細(xì)胞數(shù)×陽(yáng)性克隆百分比×MOI×病毒稀釋倍數(shù)×10^3 TU/mL
常見(jiàn)問(wèn)題解析：
Q1：protocol中使用抗生素篩選法計(jì)算滴度需要注意什么？
A1：抗生素濃度需要預(yù)先做實(shí)驗(yàn)摸好濃度，選擇最低的能夠100%殺光所有細(xì)胞的濃度。對(duì)于常見(jiàn)的Puromycin來(lái)說(shuō)，測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)是加藥2-3天后，Hygromycin是加藥4-5天后。
Q2：稀釋計(jì)數(shù)測(cè)定法與PCR法測(cè)定病毒核酸量，ELISA法測(cè)定病毒外殼蛋白量最大的區(qū)別在于？
A2：后兩種方法沒(méi)有考慮慢病毒的活性，死病毒會(huì)一并被測(cè)出來(lái)。
Q3：抗生素篩選法和熒光報(bào)告基因法有很大的區(qū)別嗎？
A3：從原理上來(lái)說(shuō)，兩種方法并沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別：它們都是計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比例，從而換算原始的病毒活性滴度。但是，若細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞比例的變異度就會(huì)增大。
熒光報(bào)告基因法的實(shí)驗(yàn)流程較短，在感染48~72小時(shí)后，待熒光基因充分表達(dá)，即可測(cè)定。 然而，抗生素法則需要等抗性基因充分表達(dá)后，再加入抗生素篩選數(shù)天，待徹底殺滅陰性細(xì)胞后，才能進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并換算滴度。
