U251細胞系是通過外植技術(shù)從惡性膠質(zhì)母細胞腫瘤中衍生而來的，U251細胞系通常用作膠質(zhì)母細胞瘤研究的實驗?zāi)Ｐ汀?U-251 MG細胞系人類已用于研究Pax6（配對盒蛋白）相關(guān)的Dkk3（Dickkopf 3）表達增加的機制，通過CRISPR/Cas9敲除PAX6的U251細胞系是常用的工具分子研究PAX6在減輕膠質(zhì)母細胞腫瘤進程中的作用。而且，U251細胞系可用于從U-251人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中提取癌干細胞，這使其在基因編輯領(lǐng)域成為受歡迎的細胞系。此外，它經(jīng)常用于研究膠質(zhì)母細胞瘤模型中JARID1B（富含Jumanji AT的交互式區(qū)域1B）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理中的作用以及艾力諾弗C聯(lián)合替莫唑胺的治療效果。因此U251細胞是用于基因敲除，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株等的合適細胞。

發(fā)現(xiàn)PAX6-敲除的U251細胞系具有增強的增殖和集落形成能力

轉(zhuǎn)錄因子PAX6在包括U251細胞系在內(nèi)的各種癌細胞系中表達。在間變性星形細胞膠質(zhì)瘤中，PAX6表達與腫瘤級別成反比，從而導致膠質(zhì)母細胞瘤（最高級別的星形細胞膠質(zhì)瘤）中PAX6表達低。

U251細胞系通常用作膠質(zhì)母細胞瘤研究的實驗?zāi)Ｐ汀Ｒ虼?，一些科學家開發(fā)了PAX6基因敲除的U251細胞系，作為分子研究工具來研究PAX6在減輕膠質(zhì)母細胞腫瘤進程中的作用。

CRISPR-Cas9技術(shù)用于敲除U251 N膠質(zhì)母細胞瘤細胞中的PAX6。指導RNA被設(shè)計成在相對于轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）在+25至+58位之間的PAX6基因5'端附近產(chǎn)生突變。強力霉素誘導的EGFP-PAX6表達載體的病毒轉(zhuǎn)導用于在PAX6基因敲除的U251細胞中重新引入（拯救）PAX6表達。通過分析形態(tài)，增殖，集落形成能力以及對氧化應(yīng)激和化學治療劑的反應(yīng)，對敲除的U251細胞進行了嚴格表征。結(jié)果表明，與WT細胞相比，敲除的U251細胞具有增強的增殖和集落形成能力，這與臨床觀察結(jié)果一致，表明PAX6可以起到抑癌作用。對于PAX6敲除的U251細胞，與PAX6對照細胞相比，處于G2/M期的細胞百分比增加，表明PAX6使U251 N細胞保持在細胞周期的G1期。有趣的是，與野生型細胞相比，PAX6敲除的U251細胞對H2O2誘導的氧化應(yīng)激更具適應(yīng)性。產(chǎn)生的U251 N PAX6-敲除細胞系可以用作研究PAX6的分子功能和機制的工具，該PAX6作為腫瘤抑制因子，涉及腫瘤的進展和膠質(zhì)母細胞瘤的治療。

?AEG-1敲除U251細胞的構(gòu)建和U251細胞中過表達的AEG-1基因顯示出降低的細胞遷移能力

星形膠質(zhì)細胞升高基因-1（AEG-1）在多種癌癥中均過表達，并且在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。研究人員通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了AEG-1基因敲除的U251細胞系，以探索AEG-1對U251細胞轉(zhuǎn)移的影響。第一步是合成針對AEG-1的設(shè)計sgRNA，然后將sgRNA克隆到pX459質(zhì)粒中以獲得AEG-1-pX459重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞，通過TA克隆測序鑒定sgRNA的活性。然后，用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)移了重組載體的U251細胞，得到AEG-1敲除的U251細胞系。蛋白質(zhì)印跡法用于檢測基因敲除的效率。最后，通過Transwell和Scratch實驗的方法評估了AEG-1敲除細胞系的遷移能力。數(shù)據(jù)顯示成功構(gòu)建了AEG-1-pX459重組載體，并通過TA克隆測序證實了sgRNA的活性，這意味著AEG-1-敲除U251細胞系已成功建立。蛋白質(zhì)印跡分析表明，U125細胞的敲除效率高達98％。從Transwell和Scratch實驗結(jié)果來看，AEG-1基因敲除細胞系的遷移能力明顯降低。

擊倒CA-NFATc1降低了U251細胞系的侵襲能力

最近的研究表明，活化T細胞的核因子（NFAT）是在侵襲性癌細胞和組織中高度表達的轉(zhuǎn)錄因子，其中之一就是U251細胞系。為了研究NFATc1在U251細胞中的作用，研究人員建立了表達NFATc1（CA-NFATc1）組成型活性形式的U251細胞系。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

源井生物根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science.?Cell Science from Technology Networks. Retrieved?2020-03-25. Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362

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