前不久我們介紹過(guò)新加坡A*STAR及國(guó)立大學(xué)陳小元/東南大學(xué)及南京醫(yī)科大學(xué)夏洪平/皖南醫(yī)學(xué)院江曉春團(tuán)隊(duì)運(yùn)用環(huán)狀RNA體外制備和LNP包封等新一代技術(shù)融合，為研究mRNA靶向治療癌癥提供了有力的參考。

詳情見(jiàn)：體外轉(zhuǎn)錄的環(huán)狀RNA可靶向線粒體內(nèi)膜心磷脂來(lái)抑制泛腺癌生成

緊接著，在2023年10月28日，四川大學(xué)華西醫(yī)院彭勇教授在Nature Communications（IF=16.6）發(fā)表文章“A circular RNA activated by TGFβ promotes tumor metastasis through enhancing IGF2BP3-mediated PDPN mRNA stability”。彭勇教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ）調(diào)控的環(huán)狀RNA——circITGB6，其本身可調(diào)控TGFβ介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。其具體機(jī)制在于，circITGB6可與IGF2BP3互作，增強(qiáng)emt促進(jìn)波多普蘭素（PDPN）的mRNA穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；而用pei包被的circITGB6-siRNA可有效抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。研究揭示了TGFβ調(diào)控的circRNA本身在腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能，并提示靶向circITGB6是一種很有前途的癌癥治療策略。

circITGB6在TGFβ誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中顯著上調(diào)，并與CRC患者預(yù)后較差密切相關(guān)

轉(zhuǎn)錄組對(duì)TGFβ處理和未處理的MCF10A細(xì)胞樣本進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，circITGB6（hsa_circ_0056856）在TGFβ處理組中表達(dá)量最高，后續(xù)也在細(xì)胞水平上有進(jìn)一步驗(yàn)證，并呈現(xiàn)劑量依賴性（圖1a-d）。這提示TGFβ可誘導(dǎo)circITGB6表達(dá)。

隨后作者驗(yàn)證了circITGB6的特性——成環(huán)/耐受切割/定位胞核和胞質(zhì)（圖1e-j）。有報(bào)道講，QKI介導(dǎo)的反向剪接參與了TGFβ誘導(dǎo)的EMT過(guò)程[1]。環(huán)狀RNA也是經(jīng)過(guò)反向剪切產(chǎn)生的。作者想看一看circITGB6表達(dá)是否和QKI有關(guān)。不過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，QKI幾乎不影響circITGB6的豐度，表明可能是其他機(jī)制導(dǎo)致TGFβ刺激下circITGB6的上調(diào)，而非QKI。

宿主基因轉(zhuǎn)錄水平的增加也可能上調(diào)circRNA的表達(dá)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)TGFβ上調(diào)circITGB6的同時(shí)，也增加了ITGB6的表達(dá)，提示circITGB6的增加可能與其宿主基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。不過(guò)定量數(shù)據(jù)表明，circITGB6是TGFβ誘導(dǎo)的主要產(chǎn)物，而非宿主轉(zhuǎn)錄本。

作者比對(duì)人類和小鼠circITGB6的序列同源性為84.24%，表明circITGB6在人和小鼠之間高度保守。實(shí)驗(yàn)表示，小鼠circITGB6也是可以被TGFβ誘導(dǎo)表達(dá)的。不過(guò)，有趣的是，circITGB6在正常小鼠乳腺組織中未檢測(cè)到，但在癌變組織中高表達(dá)，這意味著circITGB6在腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有致癌作用。

TGFβ在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。為此，作者用80個(gè)CRC樣本來(lái)檢測(cè)circITGB6相關(guān)度。在高期（III期）、大尺寸腫瘤（≥5cm）和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中，circITGB6的表達(dá)顯著增加；且CRC患者較差的預(yù)后，顯示出較高的circITGB6水平。因此，circITGB6的表達(dá)可能是CRC患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和較差預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)因子。

circITGB6誘導(dǎo)EMT過(guò)程，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

確定完circITGB6的特征及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性后，作者在體外和體內(nèi)模型中加強(qiáng)研究其生物學(xué)功能，circITGB6-OE和-KD細(xì)胞系被引入研究中。亞細(xì)胞定位顯示外源表達(dá)的circITGB6具有與內(nèi)源性相同的定位，并且，circITGB6-OE和KD均不影響宿主基因ITGB6表達(dá)，可排除circITGB6通過(guò)ITGB6通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。

circITGB6-OE顯著促進(jìn)了癌細(xì)胞遷移，而circITGB6-KD可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖2b-c）。此外，circITGB6-OE降低癌細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin水平，而提高N-cadherin和vimentin水平，而circITGB6-KD可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，這提示circITGB6是正向調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖2d-e）。

為了證實(shí)TGFβ信號(hào)激活對(duì)circITGB6的依賴性，作者使用兩種獨(dú)立的circITGB6敲低載體——shRNA1/2。結(jié)果顯示，TGFβ處理下，circITGB6的shRNA下調(diào)自身表達(dá)（圖2f）；并且circITGB6下調(diào)顯著阻斷了TGFβ刺激引發(fā)的EMT過(guò)程（上皮標(biāo)志物E-cadherin水平降低，而N-cadherin和vimentin上調(diào)）（圖2g）。與此一致，下調(diào)circITGB6對(duì)EMT過(guò)程（TGFβ誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和癌轉(zhuǎn)移有拮抗作用）（圖2h-i）。初步提示，circITGB6可作為癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物和靶向治療標(biāo)志物。

上述驗(yàn)證均在體外細(xì)胞水平完成，接下來(lái)作者通過(guò)注射SW620穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞（circITGB6過(guò)表達(dá)和對(duì)照）建立了免疫缺陷肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型。與對(duì)照組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)circITGB6的SW620細(xì)胞更容易在小鼠肝臟中形成轉(zhuǎn)移性病變（圖2j-k）。為了進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，作者又開(kāi)發(fā)了基于心內(nèi)注射的全身轉(zhuǎn)移模型來(lái)模擬癌癥進(jìn)展的臨床參數(shù)。circITGB6基因敲低顯著減少了腦和骨轉(zhuǎn)移性病變的數(shù)量和大?。▓D2l-m）。這再度提示，circITGB6在體內(nèi)能正向調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移。

circITGB6，而不是其線性轉(zhuǎn)錄本，發(fā)揮了促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用

考慮到環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生大量的線性轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本可能沒(méi)有完全轉(zhuǎn)化為環(huán)狀RNA。為了排除這種可能性，作者將circITGB6-OE質(zhì)粒從AG突變?yōu)門T，生成不能成環(huán)的（CD）突變體（圖3a-b）。與野生型相比，circITGB6-CD對(duì)EMT過(guò)程和細(xì)胞遷移沒(méi)有明顯影響；體外小鼠模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果（圖3c-f）。綜上所述，circITGB6誘導(dǎo)了EMT過(guò)程和腫瘤轉(zhuǎn)移，而不依賴于其線性轉(zhuǎn)錄本。

circITGB6與IGF2BP3相互作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

越來(lái)越多的證據(jù)表明，環(huán)狀RNA通過(guò)不同的機(jī)制參與不同的生物過(guò)程，如miRNA海綿，蛋白質(zhì)相互作用或翻譯為功能肽。數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，circITGB6沒(méi)有IRES元件，翻譯能力有限并且自身沒(méi)有多少潛在結(jié)合miRNA的位點(diǎn)，所以circITGB6應(yīng)該只可能發(fā)揮了蛋白互作。

為了鑒定circITGB6相互作用的蛋白，作者采用pulldown技術(shù)（探針?lè)ǎ┽炄〉鞍祝缓笈芸捡R斯發(fā)現(xiàn)70kDa（紅色箭頭）位置有一條蛋白條帶突出，切膠質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3（IGF2BP3）在circITGB6潛在相互作用蛋白中得分最高（圖4a-b）。隨后作者又多方面印證circITGB6結(jié)合IGF2BP3（圖4e）。此外，在TGFβ刺激下，由于circITGB6豐度的增加，IGF2BP3和circITGB6互作也增強(qiáng)（圖4f）。免疫熒光和熒光原位雜交（IF/FISH）顯示，circITGB6和IGF2BP3共定位，且不受circITGB6敲除或TGFβ應(yīng)激的影響。因此，提示circITGB6和IGF2BP3之間的相互作用沒(méi)有細(xì)胞類型/組織特異性。

為了探討IGF2BP3是否有助于circITGB6的促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用，作者建立了兩個(gè)靶向IGF2BP3的shRNA，并轉(zhuǎn)染到circITGB6-OE穩(wěn)定細(xì)胞中。結(jié)果顯示，敲除IGF2BP3可減弱circITGB6對(duì)EMT表達(dá)的影響（圖4g-h)。綜上所述，IGF2BP3可能是circITGB6發(fā)揮功能的關(guān)鍵影響因子。

circITGB6中的“CAUU”區(qū)域?qū)τ谄渑cIGF2BP3的直接相互作用至關(guān)重要

IGF2BP3優(yōu)先結(jié)合于“CAUH（H=A，U或C）”的共識(shí)元件。為了闡明circITGB6和IGF2BP3之間關(guān)聯(lián)的分子基礎(chǔ)，利用RBPmap數(shù)據(jù)庫(kù)，作者預(yù)測(cè)了circITGB6中兩個(gè)潛在的IGF2BP3結(jié)合區(qū)域（包含“CAUU”或“CAUCA”），并生成了兩個(gè)生物素標(biāo)記的RNA探針M1和M2（圖5a）。RNA pulldown顯示，內(nèi)源性IGF2BP3不與M2探針結(jié)合，而是優(yōu)先與M1探針結(jié)合（圖5b）。為了弄清楚CAUU基序是否有助于IGF2BP3的關(guān)聯(lián)，作者通過(guò)將“CAUU”雙核苷酸替換為“GUUU”，生成了一個(gè)M1突變體（M1-mut）RNA探針（圖5a）。結(jié)果顯示，M1-mut顯著消除了IGF2BP3與circITGB6之間的相互作用（圖5b），從而支持了該“CAUU”基序在介導(dǎo)circITGB6-IGF2BP3關(guān)聯(lián)中的關(guān)鍵作用。

接下來(lái)，為了確認(rèn)IGF2BP3與M1序列的直接相互作用，作者將重組的IGF2BP3蛋白與上述RNA探針?lè)跤?。pulldown和EMSA結(jié)果均證明IGF2BP3和M1之間的直接相互作用（圖5c-d）。綜上數(shù)據(jù)表明，IGF2BP3通過(guò)其CAUU基序與circITGB6結(jié)合。作者又通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和環(huán)化，生成生物素標(biāo)記的circITGB6或其GUUU突變體circITGB6-mut，然后與重組IGF2BP3蛋白孵育。與預(yù)期的一樣，circITGB6-mut幾乎沒(méi)有捕獲IGF2BP3，而circITGB6-WT與IGF2BP3表現(xiàn)出很強(qiáng)的相互作用（圖5f）。此外，作者還驗(yàn)證了IGF2BP3不和circITGB6-mut互作（圖5g-h）。最終判定為，circITGB6通過(guò)“CAUU”區(qū)域直接與IGF2BP3相互作用。并且在細(xì)胞和小鼠模型中加以驗(yàn)證，circITGB6-mut表達(dá)并不能促進(jìn)EMT過(guò)程。綜上，進(jìn)一步支持了circITGB6和IGF2BP3互作促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

circITGB6通過(guò)與IGF2BP3的相互作用調(diào)節(jié)PDPN mRNA的穩(wěn)定性

IGF2BP3通過(guò)調(diào)節(jié)RNA代謝、mRNA翻譯和細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)揮生物學(xué)作用。考慮到circITGB6通過(guò)與IGF2BP3互作促進(jìn)EMT過(guò)程和癌細(xì)胞遷移。那circITGB6是否通過(guò)調(diào)節(jié)IGF2BP3的某些mRNA載體來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的呢？

IGF2BP3可以與轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，如CD164、CD44s、MMP9和PDPN mRNA。結(jié)果顯示，circITGB6過(guò)表達(dá)，顯著提高M(jìn)MP9和PDPN基因的mRNA水平，其中PDPN的基因和蛋白水平增加最為顯著（圖6a）。并且circITGB6敲低能夠逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)對(duì)于PDPN的影響。因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)關(guān)注了PDPN基因。

已有研究表明，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中IGF2BP3與PDPN的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PDPN mRNA可能是IGF2BP3的下游RNA載體之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，circITGB6和IGF2BP3對(duì)A549細(xì)胞中PDPN pre-mRNA的表達(dá)影響不大，表明circITGB6/IGF2BP3調(diào)節(jié)PDPN的表達(dá)而不依賴于其轉(zhuǎn)錄。鑒于IGF2BP3可以穩(wěn)定其mRNA載體，作者推測(cè)circITGB6通過(guò)與IGF2BP3的相互作用來(lái)增加PDPN mRNA水平[2]。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者首先測(cè)量了強(qiáng)制表達(dá)不同circITGB6變體后的PDPN mRNA的半衰期。與預(yù)期的一樣，circITGB6-WT可以明顯延長(zhǎng)PDPN mRNA的穩(wěn)定性，并且增加IGF2BP3免疫沉淀部分中PDPN mRNA的富集，而不是circITGB6-MUT（圖6d-e）。這些結(jié)果表明，circITGB6通過(guò)促進(jìn)IGF2BP3與PDPN mRNA的相互作用來(lái)增強(qiáng)PDPN mRNA的穩(wěn)定性。

考慮到IGF2BP3通過(guò)不同的RNA結(jié)合KH結(jié)構(gòu)域與其它RNA結(jié)合，作者構(gòu)建了具有單個(gè)KH結(jié)構(gòu)域的IGF2BP3截?cái)嗤蛔凅w，分析IGF2BP3如何與circITGB6和PDPN mRNA相互作用（圖6f）。使用針對(duì)circITGB6或PDPN mRNA的探針進(jìn)行pulldown分析顯示，IGF2BP3的KH1結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合circITGB6，而KH4結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合PDPN mRNA（圖6f），這一結(jié)果排除circITGB6與PDPN mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGF2BP3的相同KH結(jié)構(gòu)域。

circITGB6通過(guò)PDPN通路誘導(dǎo)EMT過(guò)程和腫瘤轉(zhuǎn)移

為了探究circITGB6的功能是否依賴于PDPN通路，作者通過(guò)敲低circITGB6過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的PDPN來(lái)進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低PDPN抑制了circITGB6介導(dǎo)的EMT過(guò)程和細(xì)胞遷移的變化。同樣，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，敲低PDPN逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)circITGB6導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的增加（圖7g-i）。因此可以判定，circITGB6通過(guò)增強(qiáng)PDPN mRNA的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。敲低IGF2BP3顯著阻斷了TGFβ刺激下PDPN的上調(diào)、細(xì)胞遷移能力、形態(tài)轉(zhuǎn)變和EMT標(biāo)志物的變化。綜上所述，circITGB6/ IGFBP3/PDPN通路可正向調(diào)控TGFβ觸發(fā)的EMT過(guò)程和細(xì)胞遷移。

腦轉(zhuǎn)移在實(shí)體腫瘤中很常見(jiàn)，肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的傾向最高。因此，為了研究circITGB6/PDPN通路在腦轉(zhuǎn)移中的意義，作者進(jìn)行了三輪體內(nèi)訓(xùn)練，以獲得高腦轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞（BrM）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與其親本細(xì)胞相比，BrMs表現(xiàn)出更高的細(xì)胞遷移能力。重要的是，circITGB6和PDPN在BrMs中的表達(dá)均遠(yuǎn)高于親本細(xì)胞。此外，在BrM細(xì)胞中也觀察到PDPN mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，提示circITGB6/PDPN通路參與了肺癌的腦轉(zhuǎn)移。

為了進(jìn)一步證實(shí)circITGB6/PDPN通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的意義。與原發(fā)腫瘤相比，circITGB6和PDPN在轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)均增加，同時(shí)TGFβ豐度增加，e-鈣粘蛋白減少和n-鈣粘蛋白增加（圖7j）。綜上所述，TGFβ/circITGB6/PDPN通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中被激活。

敲低circITGB6可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

與沒(méi)有癌癥轉(zhuǎn)移的樣本相比，circITGB6和PDPN mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中表達(dá)更高（圖8a）。并且在CRC患者中觀察到circITGB6和PDPN mRNA水平之間存在正相關(guān)（圖8b）。在118個(gè)肺癌樣本中也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖8c-d）。因此，在CRC小鼠肝轉(zhuǎn)移模型和人類癌癥活檢中，circITGB6的表達(dá)與PDPN的豐度呈正相關(guān)。

考慮到circITGB6在腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及其與癌癥進(jìn)展的相關(guān)性，那circITGB6是否可能成為轉(zhuǎn)移前腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)呢？為此，作者設(shè)計(jì)了circITGB6的siRNA，并驗(yàn)證了其只針對(duì)circITGB6敲低，而非ITGB6轉(zhuǎn)錄本（圖8e）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circITGB6 siRNA處理有效降低PDPN在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，并重新塑造了EMT標(biāo)記物的表達(dá)，并抑制了細(xì)胞遷移；并且，敲低circITGB6后，PDPN mRNA的半衰期變短（圖7f-h）。綜上，敲低circITGB6可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

小結(jié)

環(huán)狀RNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已有很多報(bào)道。本研究也詳細(xì)地解析了circITGB6發(fā)揮腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能的機(jī)制。circITGB6可被TGFβ誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)了結(jié)直腸癌和肺癌的EMT過(guò)程和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程。在機(jī)制上，circITGB6通過(guò)與IGF2BP3的直接互作，激活I(lǐng)GF2BP3并穩(wěn)定其下游轉(zhuǎn)錄本PDPN mRNA的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。不過(guò)，circITGB6的siRNA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果令人滿意。這一重大發(fā)現(xiàn)，將為采用靶向circITGB6治療癌癥轉(zhuǎn)移的方案提供有力依據(jù)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-42571-1

參考文獻(xiàn)：

1. Conn, S. J. et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell 160, 1125–1134 (2015).

2. Bell, J. L. et al. Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins (IGF2BPs): post-transcriptional drivers of cancer progression? Cell Mol. Life. Sci. 70, 2657–2675 (2013).