近日，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院王輝教授和中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院陳有海教授為共同通訊作者，在?Cancer Immunology Research (IF:?11.151) 期刊在線發(fā)表了題為Tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2 Fosters Tumor-Associated Microbiota to Promote the Development of Colorectal Cancer的研究論文，揭示了免疫調(diào)節(jié)分子 TIPE2 通過控制腸癌驅(qū)動菌群的擴(kuò)增影響抗腫瘤免疫應(yīng)答的新機(jī)制。

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院婁運(yùn)偉副教授和碩士研究生宋苗苗為本文的并列第一作者。歐易生物在本研究中承擔(dān)了微生物多樣性測序、轉(zhuǎn)錄組測序及分析工作。

研究背景

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來大量研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群的改變密切相關(guān)并提出了CRC相關(guān)“致癌菌群”的觀點(diǎn)。通過16S rRNA測序和宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CRC患者腫瘤組織中檢測出較高含量的具核梭桿菌、大腸埃希氏菌、脆弱擬桿菌、糞腸球菌、解脲鏈球菌和消化鏈球菌等菌種，這些“驅(qū)動”菌可以通過與宿主免疫細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、與癌細(xì)胞相互作用分泌致癌毒力因子或產(chǎn)生致癌微生物代謝產(chǎn)物來促進(jìn)腫瘤的生長，然而宿主通過免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)腸道菌群進(jìn)而影響CRC進(jìn)程的分子機(jī)制仍未完全闡明。

TIPE2是近年來小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎模型中被發(fā)現(xiàn)和克隆的一個新基因，屬于TNFAIP8家族的成員。TIPE2在免疫和炎癥過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但是在腫瘤發(fā)生過程中的作用仍存在爭議，對其在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)調(diào)節(jié)和作用機(jī)制仍知之甚少。

研究路線

點(diǎn)擊圖片查看大圖

研究結(jié)果

1、TIPE2在CAC中高表達(dá)

為闡明TIPE2在腸道穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生中的潛在作用，在結(jié)直腸癌小鼠模型中檢測了其在腫瘤發(fā)生過程中的表達(dá)變化。與正常結(jié)腸組織相比，AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC小鼠模型的遠(yuǎn)端結(jié)腸腫瘤組織中TIPE2 mRNA表達(dá)明顯升高，炎癥細(xì)胞因子IL17和IL23（陽性對照）也顯著升高（Fig1A）。在Apcmice也觀察到了類似的結(jié)果，這類小鼠攜帶了一種腺瘤性大腸息肉（Apc）突變，導(dǎo)致主要在小腸內(nèi)發(fā)展為自發(fā)腫瘤（Fig1B）。在兩種小鼠模型中，TIPE2蛋白水平顯著增加（Fig1C-D）。此外，人結(jié)直腸癌樣本中TIPE2也顯著增加（Fig1E）。接著構(gòu)建攜帶GFP綠色熒光蛋白的基因敲入小鼠，通過流式發(fā)現(xiàn)TIPE2特異性表達(dá)于腸道固有層CD45+的免疫細(xì)胞，尤其是在CD45+CD11c- CD11b+MHCII-粒細(xì)胞群體中表達(dá)最高，而非CD45-的腸道上皮細(xì)胞或其它基質(zhì)細(xì)胞（Fig1H-I）。利用腫瘤微環(huán)境人單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)庫TISCH發(fā)現(xiàn)TIPE2富集于結(jié)直腸癌患者的免疫細(xì)胞群體。

Fig1 TIPE2在小鼠腸癌模型和人結(jié)腸直腸癌中表達(dá)增加

RT-qPCR分析Tipe2, Il23p1和Il17a在AOM/DSS誘導(dǎo)CAC小鼠模型和Apcmice中的表達(dá)（A and B）；WB分析其在CAC小鼠模型、Apcmice和3對結(jié)直腸腫瘤(T/N)組織中的表達(dá)（C, D and E）；GFPpopulations免疫細(xì)胞亞群分析（F, H and I）。

2、TIPE2缺陷可減輕由炎癥誘發(fā)的CAC腫瘤發(fā)生發(fā)展

進(jìn)一步探究了TIPE2在AOM/DSS小鼠結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。由于高死亡率，將DSS劑量降低到2.5%（Fig2A）。經(jīng)AOM/DSS處理，Tipe2mice表現(xiàn)出顯著的體重減輕和加速恢復(fù)（Fig2B），且腫瘤明顯變小。說明TIPE2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用（Fig2C-G）。為進(jìn)一步探究TIPE2是否是通過髓系系統(tǒng)來影響小鼠腸癌進(jìn)程的，構(gòu)建了四組小鼠骨髓嵌合體模型，WT????? >Tipe2, WT >WT ,Tipe2?>WT ,Tipe2?>Tipe2，誘導(dǎo)小鼠實驗性腸癌，結(jié)果表明，TIPE2是通過髓系系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸癌發(fā)生過程的（Fig2H-K）。

Fig2 TIPE2缺失可降低腫瘤發(fā)生的易感性

AOM/DSS處理過程中生存曲線分析（A）；Tipe2mice體重、病理、結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤負(fù)荷、腫瘤大小分布結(jié)果（B-G）；四組小鼠骨髓嵌合體模型小鼠macroscopic images、病理、結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤負(fù)荷結(jié)果（H-K）。

3、TIPE2缺陷降低了Apcmin/+模型的死亡率和腫瘤負(fù)荷

結(jié)直腸癌中TIPE2表達(dá)與患者生存率密切相關(guān)（Fig3A）。80%以上結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)出APC基因突變，因此構(gòu)建了Apmice用于研究。與ApcTipe2mice相比，ApcTipe2mice的生存時間增加，體重顯著增加；在TIPE2缺陷的遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸中腫瘤數(shù)量和腫瘤負(fù)荷均顯著減少（Fig3B-G）；表明缺失TIPE2可以抑制小腸和結(jié)腸的腸道腫瘤發(fā)生。

Fig3 TIPE2缺失可降低腫瘤發(fā)生率

Human Protein ATLAS database中患者生存曲線分析（A）；ApcTipe2和ApcTipe2mice的生存時間、體重、macroscopic images、結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤負(fù)荷結(jié)果（B-G）。

已知炎癥在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，炎癌轉(zhuǎn)化是很多疾病惡化的罪魁禍?zhǔn)?。流式檢測了小鼠腸炎相關(guān)腸癌早期炎癥階段腸道組織中炎性細(xì)胞的群體變化，用7-AAD區(qū)分死活細(xì)胞以CD45+ CD11b+標(biāo)記髓系細(xì)胞，實驗結(jié)果顯示，TIPE2缺失后，死亡的髓系細(xì)胞明顯減少；緊接著采用Q-PCR技術(shù)檢測了炎癥相關(guān)的信號分子，發(fā)現(xiàn)促炎因子的mRNA水平降低。表明TIPE2缺失后可以抑制腸癌早期的炎癥階段。

4、TIPE2缺陷可改善炎癥相關(guān)的菌群失調(diào)

腸道炎癥常與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，16S rRNA測序分析了WT和Tipe2mice的腸道菌群組成。在Tipe2mice中變形菌門（Proteobacteria）豐度下降，其中變形菌門中的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）顯著下調(diào)表達(dá)（Fig4A-C）。在特定條件下培養(yǎng)大腸桿菌（E. coli），經(jīng)CAC誘導(dǎo)后E. coli擴(kuò)張（Fig4D）。經(jīng)DSS處理，變形菌門、腸桿菌科和大腸桿菌表現(xiàn)出過度生長（Fig4E-F）。這些結(jié)果表明：TIPE2缺陷可改善與炎癥相關(guān)的腸道菌群失調(diào)。

Fig4 TIPE2缺陷可改善炎癥相關(guān)的腸道菌群失調(diào)

WT和Tipe2mice的腸道菌群組成、PCoA、family level表達(dá)分析（A-C）；E. coli特定條件下培養(yǎng)；QPCR分析Proteobacteria phylum, Enterobacteriaceae family, E. coli, and Lactobacillus species在intestinal luminal specimens (E) or colon mucosal surface (F)中的表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究TIPE2在腫瘤發(fā)生過程中的作用機(jī)制，通過RNA-seq分析比較AOM/ dss處理和未處理小鼠的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組。AOM/DSS untreated WT和Tipe2mice中鑒定到1791個上調(diào)基因和1338個下調(diào)基因，差異基因主要富集在免疫相關(guān)的pathway（如cytokine–cytokine receptor interaction等）（Fig5A-C）。AOM/DSS WT和Tipe2mice中鑒定到382個上調(diào)基因和73個下調(diào)基因，差異基因主要富集在inflammation-associated small-molecule biosynthesis and carcinogenesis pathways（Fig5D）。

Fig5 Tipe2mice表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組變化

WT和Tipe2mice結(jié)腸組織中0天和90天的差異基因變化（A）；AOM/DSS untreated WT和Tipe2mice差異基因的KEGG富集結(jié)果和差異基因表達(dá)（B-C）；AOM/DSS treated WT和Tipe2mice差異基因的KEGG富集結(jié)果（D）。

Tipe2mice與WT 的糞便16s rRNA結(jié)果表明：Tipe2mice與WT分別聚集在一起，表明Tipe2mice的微生物群組成發(fā)生了變化，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和大腸桿菌-志賀氏菌（Escherichia-Shigella）在Tipe2mice中顯著下調(diào)表達(dá)（Fig6A-F）。

Fig6 Tipe2mice腸道菌群發(fā)生了變化

WT和Tipe2mice糞便PCoA分析（A）；family和genus的菌群表達(dá)分析（B和E） ；糞便樣本Enterobacteriaceae和Escherichia-Shigella的定量分析（C和F）；結(jié)腸組織中p-H2A.X的蛋白水平分析（D）。

5、結(jié)腸微生物群在腫瘤發(fā)生中的作用至關(guān)重要

FMT結(jié)果表明：Tipe2mice腸道菌群的改變可以抑制CAC的發(fā)生發(fā)展。接下來采用抗生素處理來清除腸道菌群進(jìn)行功能研究，抗生素處理后可抑制腫瘤形成、降低腫瘤數(shù)量和腫瘤負(fù)荷（Fig7A-D）。流式分析顯示了骨髓細(xì)胞的浸潤，如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；此外，免疫相關(guān)基因Il17a, Il22, Il23p19 and ccl2表達(dá)水平顯著下降（Fig7E-I）。

Fig7 Tipe2mice腸道菌群在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要

抗生素清除后，Tipe2和WT mice的病理變化（A-D）和免疫細(xì)胞分析（E-H）以及免疫相關(guān)基因的定量分析（I）。

研究結(jié)論

在這項研究中，首先發(fā)現(xiàn)TIPE2在小鼠腸道腫瘤和人結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)TIPE2高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的低生存率密切相關(guān)。對于小鼠腸癌的影響在兩種小鼠結(jié)直腸癌模型即化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠腸癌模型和小鼠自發(fā)腸癌模型中，發(fā)現(xiàn)TIPE2缺陷抑制了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。通過16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的microbiota（Enterobacteriaceae/E. coli）存在顯著差異。為了進(jìn)一步確認(rèn)microbiota在腸癌進(jìn)程中的作用，通過co-housing、抗生素清除和糞菌移植實驗證實TIPE2通過控制microbiota誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)腸道腫瘤的生長過程。

綜上所述，利用生物信息學(xué)分析、臨床樣本和動物模型揭示了TIPE2能夠通過調(diào)控腫瘤相關(guān)microbiota的擴(kuò)增促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，為腸道腫瘤免疫治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-21-0666

猜你想看

• 2022年了，單細(xì)胞技術(shù)課題設(shè)計早已沒那么簡單 | 內(nèi)有福利

• 空間轉(zhuǎn)錄組項目疑慮多？小歐為您來解惑~

• 項目文章 | 山東大學(xué)王顯偉團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)對蝦抵抗細(xì)菌感染的新機(jī)制

• 項目文章 | 歐易生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序教你如何挖掘lncRNA數(shù)據(jù)！
  

本文系歐易生物原創(chuàng)