16S+代謝組學(xué)助力AgNPs生態(tài)研究新視角再登環(huán)境科學(xué)TOP期刊
前言
隨著納米材料的產(chǎn)業(yè)化,各種形式的納米材料將以不同途徑進(jìn)入人們的生活,納米材料的生物安全性問題正受到世界各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注，本篇為2020年2月，南京大學(xué)趙麗娟課題組在雜志發(fā)表題為“Silver Nanoparticles Alter Soil Microbial Community Compositions and Metabolite Profiles in Unplanted and Cucumber-planted Soil”的研究論文。該研究運(yùn)用16S rRNA基因測序、GC-MS非靶向代謝組技術(shù)對土壤微生物組和代謝組學(xué)分析技術(shù)的獨(dú)特結(jié)合，提供了對AgNPs生態(tài)影響的全新視角，全面了解了AgNPs暴露對土壤微生物的影響。
標(biāo)題：銀納米顆粒改變種植和未種植黃瓜土壤中的微生物群落組成和代謝物譜
期刊：Environmental Science & Technology
影響因子：9.028
發(fā)表時(shí)間：2020年2月
合作單位：南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院
運(yùn)用生物技術(shù)：16S rRNA基因測序、GC-MS非靶向代謝組（由鹿明生物提供技術(shù)支持）
研究背景
銀納米顆粒（AgNPs）是使用最廣泛的工程納米材料之一，泄露可能導(dǎo)致顆粒在土壤中積累，并對環(huán)境造成未知風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)告指出AgNPs可能通過影響根系分泌物間接對微生物群落功能和基因組多樣性產(chǎn)生顯著影響，但對其機(jī)理了解甚少。土壤代謝物可作為土壤微生物群落變化的表型特征，但當(dāng)前有關(guān)NPs暴露對土壤微生物群落影響的研究不包括對土壤代謝產(chǎn)物的分析。16S rRNA基因序列可以提供改變的土壤微生物群相關(guān)信息，鑒于它們的已知功能，人們可以對土壤生物化學(xué)的變化提出合理假設(shè)。本文作者利用16S rRNA基因測序和非靶向代謝組學(xué)方法，研究了AgNPs對土壤微生物群落的長期影響。
研究思路
實(shí)驗(yàn)方法
四種處理方法：A組-土壤，B組-土壤+100 mg / kg AgNPs，C組-土壤+植物，D組-土壤+植物+100 mg / kg AgNPs，每種處理均重復(fù)四次。
土壤pH值、溶解的有機(jī)碳、常量/微量元素含量。
光合色素、總酚含量、脂質(zhì)過氧化作用
GC-MS非靶向代謝分析
16S rRNA基因測序
①代謝組數(shù)據(jù)：有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）聚類，VIP值大于1篩選對分類有貢獻(xiàn)化合物，使用MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行生物途徑富集分析，篩選閾值0.1。
②其他數(shù)據(jù)：MDA、光合色素和土壤養(yǎng)分元素、TOC和pH的含量進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析（p<0.05）。
研究結(jié)果
暴露于AgNPs 60天后，作者評估了土壤溶解的有機(jī)物含量（DOM）、pH值和元素含量。結(jié)果表明無論是否種植植物，暴露于AgNPs的土壤pH值均會(huì)增加，但土壤DOM不會(huì)改變。但種植黃瓜的土壤中，被測元素的生物利用度隨AgNPs的存在而顯著增加（表1）。
表1 | 土壤中可提取的常量和微量元素（mg / kg干重）
為了確定土壤微生物群落對AgNPs暴露的響應(yīng)，作者在IIIumina MiSeq平臺上進(jìn)行了高通量土壤細(xì)菌16S rRNA基因測序。在AgNPs處理和未處理的土壤中，變形桿菌、放線菌、酸性桿菌、綠彎曲菌、擬桿菌和芽孢桿菌是最重要的菌群。PCoA結(jié)果表明，AgNPs顯著改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（p=0.035）。暴露在AgNPs下，土壤細(xì)菌群落每個(gè)分類的豐富度顯著增加（圖1）。
圖1?| 微生物群落豐富度（Sobs指數(shù)）
A土壤，B土壤+ AgNPs，C土壤+植物，D土壤+植物+ AgNPs。
眾所周知，AgNPs具有微生物毒性。作者發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌、降解幾丁質(zhì)并水解纖維素的微生物、多糖水解有關(guān)的微生物、降解高分子量化合物的擬桿菌、碳循環(huán)相關(guān)細(xì)菌群的相對豐度發(fā)生了變化，AgNPs暴露可能會(huì)對土壤微生物組中的糖和有機(jī)酸代謝產(chǎn)生負(fù)面影響，隨之對碳轉(zhuǎn)移、代謝、儲存和土壤有機(jī)碳庫組成產(chǎn)生潛在影響。AgNPs暴露也對土壤中氮循環(huán)相關(guān)的微生物群，以及生物和非生物脅迫的耐受性的微生物群產(chǎn)生了負(fù)面或正面影響（圖2）。另外發(fā)現(xiàn)污染物降解相關(guān)的微生物也明顯減少?？傊?，AgNPs暴露改變了參與碳、氮和磷循環(huán)，病原體抗性和污染物降解的細(xì)菌群的相對豐度。
圖2?| AgNPs存在的情況下，相對豐度發(fā)生顯著變化的微生物分類熱圖
I：A（土壤）與B（土壤+ AgNPs）；
II：C（土壤+植物）對D（土壤+植物+ AgNPs）；
綠色和紅色標(biāo)記的細(xì)菌類群分別代表I和II組的下調(diào)和上調(diào)
在種植黃瓜的土壤中，主要的微生物群落與未種植的土壤相同，并且AgNPs暴露顯著（p=0.034）改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，表明不論植物存在與否，AgNPs暴露都會(huì)顯著改變土壤微生物組成。
與未種植黃瓜的土壤相反，種植黃瓜的土壤暴露于AgNPs后，各個(gè)水平（從門到屬）的土壤微生物群落豐富度均顯著降低（圖1）。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)AgNPs也可能損害黃瓜種植土壤中的碳、氮和磷循環(huán)相關(guān)微生物群，表明植物在減弱AgNPs暴露對土壤微生物群落的負(fù)面影響方面發(fā)揮的作用有限。但鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇單孢菌科微生物群例外，其相對豐度在未種植的土壤中顯著降低，但在種植黃瓜且暴露于AgNPs的土壤顯著增加（圖2II）。
有幾種微生物相對豐度僅在種植黃瓜的土壤中顯著降低（圖2II），包括葉綠單胞菌類（厭氧科和葉綠藻）、變形桿菌屬類（粘球菌）和吡喃單胞菌類。表明在植物存在下，AgNPs暴露可能會(huì)對土壤碳水化合物的代謝和污染物的降解產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而對植物代謝、生長和對病原體抗性產(chǎn)生重大影響。
土壤代謝物可以間接反映微生物代謝過程的變化，使用基于GC-MS的非靶向代謝組學(xué)，在土壤樣品中共鑒定272種代謝物并對其進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)定量，定量結(jié)果表明AgNPs暴露顯著改變了土壤代謝物的分布。通過參數(shù)VIP>1.5，在土壤中鑒定出20種具有重要變化的代謝物（圖3I），除少數(shù)幾個(gè)代謝物上調(diào)，大多數(shù)代謝物減少，表明AgNPs暴露通常會(huì)對土壤微生物的代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。
值得注意的是，在AgNPs暴露后，許多脂肪酸及其前體含量顯著降低，包括十五烷酸、棕櫚油酸、亞油酸、棕櫚酸、十七烷酸和油酸（圖3I）。微生物會(huì)在不同環(huán)境條件下產(chǎn)生不同鏈長和組成的磷脂脂肪酸（PLFA），以維持細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞功能。PLFA的改變可能是由于AgNPs誘導(dǎo)ROS過度生成，氧化微生物細(xì)胞膜上的脂肪酸。微生物群落可調(diào)節(jié)膜PLFA以響應(yīng)AgNPs誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)。PLFA也可用于估算土壤中的生物量，PLFA水平降低可能表明AgNPs降低了微生物生物量。
在AgNPs暴露后，特定糖和氨基酸的含量也發(fā)生顯著改變。例如半胱氨酸-甘氨酸的上調(diào)可能表明土壤微生物群落某些成員的抗氧化防御系統(tǒng)被激活，木糖內(nèi)酯減少可能表明微生物的脫氫酶活性受到損害，多糖N-乙酰基-D-甘露糖胺顯著降低和其他多糖的下調(diào)印證了AgNPs對土壤碳循環(huán)的負(fù)面影響。
生物途徑分析表明，5條與碳代謝相關(guān)的微生物代謝途徑發(fā)生了顯著改變，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、嘧啶代謝和谷胱甘肽代謝。表明暴露于AgNPs顯著影響微生物基本代謝過程，尤其是碳代謝。
土壤代謝組學(xué)可以揭示土壤微生物群落如何在分子水平上應(yīng)對AgNPs并作出反應(yīng)，包括毒性機(jī)制和解毒策略。
植物不斷向根際分泌大量代謝產(chǎn)物，在植物存在的情況下，土壤代謝產(chǎn)物由植物分泌的代謝產(chǎn)物和微生物群落的外源代謝產(chǎn)物組成。結(jié)果表明，種植黃瓜的土壤在AgNPs暴露中也改變了代謝產(chǎn)物的分布。PLS-DA得分圖顯示土壤+植物+ AgNPs組與土壤+植物組可明顯分開，表明暴露于AgNPs下的根際代謝組與對照組有很大區(qū)別。其中一些代謝物與未種植黃瓜土壤中的代謝產(chǎn)物重疊，例如在黃瓜種植的土壤中也觀察到脂肪酸顯著減少（圖3II），表明植物根系分泌物不會(huì)顯著改變AgNPs對土壤微生物的負(fù)面影響。
還有一些代謝物僅在黃瓜種植的土壤觀察到變化，包括上調(diào)的蔗果三糖、羊毛甾醇、果糖-1-磷酸、槐糖、葡萄糖；下調(diào)的木糖酸、富馬酸、左旋葡聚糖、γ-氨基丁酸、瓜氨酸和β-丙氨酸。表明AgNPs顯著改變了根分泌物的組成，間接影響微生物群落。
另外作者發(fā)現(xiàn)AgNPs暴露顯著降低了黃瓜組織（根，莖和葉）的生物量，表明具有明顯的植物毒性。雖然葉綠素含量沒有變化，但是黃瓜葉片中MDA的水平顯著增加，表明發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。另外黃瓜葉片中的總酚類（抗氧化劑中的抗氧化劑成分）也顯著增加，表明AgNPs誘導(dǎo)了黃瓜植株的氧化脅迫。
圖3?| PLS-DA篩選出的代謝物（VIP值≥1或1.5）熱圖
I ：A（土壤）與B（土壤+ AgNPs）發(fā)生顯著變化的代謝產(chǎn)物；
II：C（土壤+植物）vs. D（土壤+植物+ AgNPs）;
III ：A（土壤）與C（土壤+植物）。
綠色方塊表示下調(diào)，紅色方塊表示上調(diào).
通過PLS-DA模型可以得知植物根際土壤和未種植土壤的代謝產(chǎn)物分布顯著不同，在植物存在下，很多代謝產(chǎn)物顯著增加（圖3III），表明植物釋放的代謝產(chǎn)物比土壤微生物貢獻(xiàn)的更多。有機(jī)酸、糖、脂肪酸和氨基酸表達(dá)增加，為土壤微生物群落提供了豐富的碳和能量來源。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
作者使用16S rRNA測序和土壤代謝組學(xué)，評估了AgNPs暴露對種植和未種植植物的土壤中微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)：
①AgNPs改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐富度，在某些關(guān)鍵的有益/功能細(xì)菌中誘導(dǎo)了重大轉(zhuǎn)變，例如涉及碳、氮和磷循環(huán)和病原體抑制的細(xì)菌。
②在種植植物的土壤中，土壤微生物組中的變化可能會(huì)通過影響?zhàn)B分獲取、生物控制和脅迫耐受性的關(guān)鍵功能而損害植物的生長。
③無論種植植物與否，AgNPs暴露都會(huì)改變土壤代謝產(chǎn)物的分布，表明微生物群落的活性和代謝過程受到干擾。
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