前言

2022年9月，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院姚麗芬教授課題組（一作：閆珍珍）在Brain Behavior and Immunity期刊發(fā)表了題為 “Role of gut microbiota-derived branched-chain amino acids in the pathogenesis of Parkinson’s disease: An animal study ”的研究成果，通過氣相色譜-質譜法、免疫學、GC-MS靶向代謝組學、微生物16S rRNA基因測序研究方法，發(fā)現了腸道微生物群代謝的動態(tài)變化特征，探究了BCAAs調節(jié)PD的機理，描繪了BCAAs影響腸道微生物群和炎癥因子圖譜，為帕金森疾病的深入研究提供了理論依據。

中文標題：腸道菌群衍生物支鏈氨基酸在帕金森病發(fā)病機制中的作用：動物研究

研究對象：小鼠

發(fā)表期刊：Brain Behavior and Immunity

影響因子：19.227

發(fā)表時間：2022年09月

合作單位：哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

運用組學技術：氣相色譜-質譜法、免疫學、GC-MS靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術支持）、16S rRNA基因測序（由歐易生物提供技術支持）

研究背景

帕金森?。≒D）是一種慢性進行性神經退行性疾病。迄今為止，PD治療仍以增加左旋多巴，誘導大腦剩余的多巴胺能神經元末端多巴胺的合成來改善運動功能。本篇文章以腸道微生物群及其代謝產物為研究對象，進一步探究與PD有關的發(fā)病機制。

研究思路

實驗方法

1. 實驗分組

（1）PD模型組（口服魚藤酮）：每組10只小鼠

0周組（魚藤酮未治療）；3周組（連續(xù)3周魚藤酮治療）；4周組（持續(xù)4周魚藤酮治療）

（2）BCCAs組：每組9只小鼠

對照組；魚藤酮組；魚藤酮+高BCAAs組小鼠為6至8周齡雄性C57BL/6

2. 技術路線

2.1 行為測試：爬桿實驗、轉軸試驗、糞便量

2.2糞便分析：DNA提取和擴增、16S rRNA 基因測序

2.3 代謝組學：血清分析

2.4氣相色譜-質譜法：血清氨基酸分析

2.5免疫學：腦、結腸分析

2.6酶聯免疫吸附試驗：TNF-α、IL-1β、IL-6、LBP分析

3. 統計分析

S-t檢驗、Tukey事后檢驗的單向方差分析

研究結論

1. 魚藤酮對PD小鼠腸道和運動功能及α-syn病理學的影響

魚藤酮對小鼠腸道功能的毒性作用，通過觀察1小時內的糞便排出量進行評估。與0周小鼠相比，3周、4周小鼠的糞便顆粒排出頻率、糞便濕重和糞便水含量顯著降低，4周小鼠比0周小鼠的減少更顯著（圖1C-E）。小鼠行為學測試發(fā)現，魚藤酮治療4周后，其爬桿時間顯著延長、桿上掉落時間明顯降低（圖1F-G）。

免疫熒光顯示，與0周小鼠相比，3周和4周小鼠結腸中的P-α-syn及服用魚藤酮4周的小鼠黑質（SN）中的P-α-syn均顯著增加（圖2A-D）。隨著魚藤酮治療時間延長，SN中TH的表達降低（圖2B-E）。魚藤酮治療3周的小鼠主要顯示腸功能障礙，魚藤酮治療4周的小鼠表現腸道功能障礙和運動功能障礙。

圖1 | 魚藤酮破壞小鼠的腸道和運動功能

圖2 | 魚藤酮介導結腸和SN的病理改變

2. 魚藤酮影響小鼠腸道微生物群的組成

小鼠服用魚藤酮后，比較0周、3周和4周的微生物組群。與0周組相比，3周組富含厚壁菌，并伴有明顯的擬桿菌。3周組的厚壁菌與擬桿菌的比率（F/B）比0周組高230%。與3周組相比，4周組的厚壁菌豐度顯著下降，且4周組中的F/B比3周組下降51.6%（圖3）。

圖3 | 腸道微生物組在門分類水平上的概況

3.魚藤酮引起的腸道微生物群多樣性變化

對0周、3周和4周小鼠的α-多樣性和β-多樣性進行微生物群落結構評估。0周和3周組中，α-多樣性沒有顯著差異，但在0周和4周組之間Chao1指數增加顯著。與3周組相比，4周組的Simpson指數顯著降低。通過未加權UniFrac、布雷-柯蒂斯距離Bray-Curtis距離和PCoA分析顯示，三組之間的細菌組成存在明顯差異。通過PCoA分析表明，魚藤酮可引發(fā)微生物的組成發(fā)生變化（圖4）。

圖4 | 魚藤酮處理小鼠腸道微生物多樣性的變化

4. 魚藤酮處理時間引起的微生物群落動態(tài)變化

通過熱圖顯示的聚類分析，確定了魚藤酮處理0周、3周和4周組中微生物類群的變化，發(fā)現魚藤酮與特定的細菌富集。叢毛單胞菌、嗜糖假單胞菌、螺旋桿菌、Ambiguous taxa 、普氏菌科NK3B31組、瘤胃球菌科UCG-014和厚螺旋菌科UCG-001的相對豐度增加，而洋海洋螺菌、桿菌屬、未培養(yǎng)的酸性細菌、地溫桿菌、蘇特雷拉菌、普雷沃菌、莫爾干菌、未培養(yǎng)的擬乳桿菌、加德納氏菌、梭桿菌和糞桿菌的微生物群落更豐富。觀察魚藤酮處理3周和4周的小鼠與腸道菌群的動態(tài)變化，發(fā)現乳桿菌、毛螺菌、類香味菌、乳球菌、棒狀桿菌1、葡萄球菌、氣單胞菌、AqS1、擬桿菌、嗜血桿菌、巨球菌、海洋球菌在治療組中富集，而腸鼠桿菌 Muribaculum、毛螺旋菌屬、杜氏乳桿菌、固氮螺菌47_25，Turiibacter和回腸桿菌在4周組中的含量顯著增加（圖5）。

圖5 | 0周、3周和4周組魚藤酮處理小鼠腸道微生物群的屬級分類變化

5. 腸道細菌標志物與魚藤酮的相關性

治療時間根據RF機器學習算法，分別建立0周與4周、0周與3周、3周與4周組的預測模型。預測模型可分為0周組和4周組，腸道微生物群變異達到了92.41%。0周組中，糞桿菌、梭桿菌、未培養(yǎng)的乳桿菌和嗜血桿菌富集，而Muribaculum、Turicibacter、Ileibacterium和Pelomonas在4周組中富集。3周和4周的RF預測模型組中，隨著魚藤酮處理時間的增加，前9個類群中的5個類群的相對豐度明顯降低，包括乳酸桿菌、乳球菌、葡萄球菌和氣單胞菌。而0周組和3周組之間的差異很小，且預測模型的總體解釋率為43.94%（圖6）。

?圖6 | 魚藤酮處理小鼠的腸道微生物標志物

6. 魚藤酮處理小鼠血清氨基酸產生的變化

GC-MS代謝組學對19種氨基酸進行鑒定和定量。根據OPLS-DA模型，0周組和4周組之間分離度較好，再以OPLS-DA的VIP識別潛在的生物標志物。發(fā)現了VIP得分大于1的8種氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸、天冬酰胺和L-4-羥脯氨酸。S- t檢驗篩選了0周組和4周組之間的差異代謝物，與0周組相比，4周組降低明顯，且纈氨酸水平也有所下降，但兩組間沒有顯著差異。MetaboAnalyst 5.0分析魚藤酮治療0周和4周組間代謝物的不同途徑，4周組的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑豐富（圖7）。

圖7 | 魚藤酮治療0周和4周小鼠的氨基酸代謝模式

7. 高BCAAs飲食減輕了魚藤酮誘導模型小鼠的行為和病理特征

高BCAAs飲食顯著改善了口服魚藤酮引起的腸道功能障礙。與對照組相比，魚藤酮組在測試中顯示出更長的爬桿時間，旋轉試驗中顯示出更短的潛伏期，表明高BCAAs飲食可緩解魚藤酮的運動缺陷。高BCAAs飲食也恢復了SN中多巴胺能神經元的損傷，并改善了魚藤酮引起的TH陽性神經元的減少情況（圖8）。

圖8 | 高BCAA飲食可減輕魚藤酮誘導PD小鼠的腸道功能障礙、運動障礙和多巴胺能神經元損傷

8. 高BCAAs飲食可減輕小鼠的炎癥反應

ELISA分析測量模型小鼠的LBP血清濃度，與對照組相比，LBP的血清水平顯著高于魚藤酮組。高BCAAs飲食組的血清LBP水平明顯低于魚藤酮組。此外，ELISA結果顯示，魚藤酮組結腸和SN中促炎因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-6）的水平明顯高于魚藤酮組，表明高BCAAs飲食能夠降低這三種促炎細胞因子的水平（圖9）。

圖9 | 高BCAA飲食可減輕魚藤酮誘導PD小鼠的炎癥反應

相關討論

本篇研究，首次揭示了高BCAAs飲食對魚藤酮誘導的PD小鼠的保護作用，同時表征了不同時間魚藤酮治療小鼠的腸道微生物組，并鑒定了與PD進展相關的微生物標志物。通過靶向代謝組學也確定了血清中BCAAs水平的降低。說明腸道微生物群及其代謝產物的失調在PD發(fā)病機制中的重要性，表明高劑量補充BCAAs可能是治療PD的新方向，但需要深入探究BCAAs在PD中的可能機制。

研究分析發(fā)現，高BCAAs飲食改善了PD小鼠的腸道功能失調，并逆轉運動功能障礙，同時也恢復了多巴胺能神經元的損傷。高BCAAs飲食也降低了PD小鼠的炎癥水平，表現為血清LPS結合蛋白濃度降低、結腸及黑質中的促炎因子（TNF-α、IL-1β及IL-6）水平降低。

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研究通過氣相色譜-質譜法、免疫學、GC-MS靶向代謝組學、微生物16S rRNA基因測序方法，發(fā)現腸道微生物群和支鏈氨基酸（BCAAs）代謝的動態(tài)變化，可緩解改善PD的發(fā)病癥狀，即高BCAAs飲食通過調節(jié)炎癥水平而改善PD。為PD的深入研究提供了新策略和新方向。

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（GC-MS靶向代謝組學、微生物16S rRNA基因測序方法）

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